Immunofluorescence - Immunofluorescence

Microphotographie d'une coupe histologique de peau humaine préparée pour l'immunofluorescence directe à l' aide d'un anticorps anti-IgA. La peau provient d'un patient atteint de purpura de Henoch-Schönlein : des dépôts d'IgA se trouvent dans les parois de petits capillaires superficiels (flèches jaunes). La zone verte pâle et ondulée en haut est l' épiderme , la zone fibreuse en bas est le derme .
Ces chiffres démontrent le mécanisme de base de l'immunofluorescence. L'immunofluorescence primaire est représentée sur la gauche, qui montre un anticorps avec un groupe fluorophore lié directement à l'épitope de l'antigène pour lequel il est spécifique. Une fois que l'anticorps se lie à l'épitope, l'échantillon peut être visualisé au microscope à fluorescence pour confirmer la présence de l'antigène dans l'échantillon. A l'inverse, l'immunofluorescence secondaire est représentée à droite, ce qui montre que d'abord un anticorps primaire non marqué se lie à l'épitope de l'antigène selon un mécanisme similaire à celui décrit ci-dessus. Cependant, une fois que les anticorps primaires se sont liés à leur cible, un anticorps secondaire (marqué avec un fluorophore) arrive. Les sites de liaison de cet anticorps secondaire sont spécifiques de l'anticorps primaire qui est déjà lié à l'antigène, et donc l'anticorps secondaire se lie à l'anticorps primaire. Cette méthode permet à plus d'anticorps marqués par un fluorophore de se fixer à leur cible, augmentant ainsi le signal fluorescent pendant la microscopie.

L'immunofluorescence est une technique utilisée pour la microscopie optique avec un microscope à fluorescence et est principalement utilisée sur des échantillons microbiologiques . Cette technique utilise la spécificité des anticorps contre leur antigène pour cibler des colorants fluorescents sur des cibles biomoléculaires spécifiques au sein d'une cellule, et permet donc la visualisation de la distribution de la molécule cible à travers l'échantillon. La région spécifique qu'un anticorps reconnaît sur un antigène est appelée épitope. Des efforts ont été faits dans la cartographie des épitopes car de nombreux anticorps peuvent se lier au même épitope et les niveaux de liaison entre les anticorps qui reconnaissent le même épitope peuvent varier. De plus, la liaison du fluorophore à l'anticorps lui-même ne peut pas interférer avec la spécificité immunologique de l'anticorps ou la capacité de liaison de son antigène. L'immunofluorescence est un exemple largement utilisé d' immunocoloration (utilisant des anticorps pour colorer les protéines) et est un exemple spécifique d' immunohistochimie (l'utilisation de la relation anticorps-antigène dans les tissus). Cette technique utilise principalement des fluorophores pour visualiser l'emplacement des anticorps.

L'immunofluorescence peut être utilisée sur des coupes de tissus, des lignées cellulaires cultivées ou des cellules individuelles, et peut être utilisée pour analyser la distribution de protéines , de glycanes et de petites molécules biologiques et non biologiques. Cette technique peut même être utilisée pour visualiser des structures telles que des filaments de taille intermédiaire. Si la topologie d'une membrane cellulaire n'a pas encore été déterminée, l'insertion d'épitopes dans des protéines peut être utilisée conjointement avec l'immunofluorescence pour déterminer les structures. L'immunofluorescence peut également être utilisée comme méthode "semi-quantitative" pour mieux comprendre les niveaux et les schémas de localisation de la méthylation de l'ADN, car il s'agit d'une méthode plus longue que les véritables méthodes quantitatives et il y a une certaine subjectivité dans l'analyse des niveaux de méthylation. L'immunofluorescence peut être utilisée en combinaison avec d'autres méthodes de coloration fluorescente sans anticorps, par exemple, l'utilisation de DAPI pour marquer l' ADN . Plusieurs modèles de microscopes peuvent être utilisés pour l'analyse d'échantillons d'immunofluorescence ; le plus simple est le microscope à épifluorescence , et le microscope confocal est également largement utilisé. Diverses conceptions de microscopes à super-résolution capables d'une résolution beaucoup plus élevée peuvent également être utilisées.

Les types

Microphotographie d'une coupe histologique de peau humaine préparée pour l'immunofluorescence directe à l' aide d'un anticorps anti-IgG. La peau provient d'un patient atteint de lupus érythémateux disséminé et présente un dépôt d'IgG à deux endroits différents : Le premier est un dépôt en forme de bande le long de la membrane basale épidermique (le « test de la bande de lupus » est positif). La seconde se situe dans les noyaux des cellules épidermiques (anticorps anti-nucléaires).

Préparation de la fluorescence

Pour fabriquer des anticorps marqués au fluorochrome, un fluorochrome doit être conjugué (« marqué ») à l'anticorps. De même, un antigène peut également être conjugué à l'anticorps avec une sonde fluorescente dans une technique appelée technique de l'antigène fluorescent. Les procédures de coloration peuvent s'appliquer à la fois à l'antigène fixé dans le cytoplasme ou aux antigènes de surface cellulaire sur des cellules vivantes, appelées « immunofluorescence membranaire ». Il est également possible de marquer le complément du complexe anticorps-antigène avec une sonde fluorescente. En plus de l'élément auquel les sondes de fluorescence sont attachées, il existe deux classes générales de techniques d'immunofluorescence : primaire et secondaire. Les descriptions suivantes se concentreront principalement sur ces classes en termes d'anticorps conjugués.

Il existe deux classes de techniques d'immunofluorescence, primaire (ou directe) et secondaire (ou indirecte).

Primaire (direct)

L'immunofluorescence primaire (directe) utilise un seul anticorps primaire, chimiquement lié à un fluorophore . L'anticorps primaire reconnaît la molécule cible (antigène) et se lie à une région spécifique appelée épitope. Ceci est accompli par un processus qui manipule la réponse immunitaire de l'organisme avec une immunité adaptative. Le fluorophore attaché peut être détecté par microscopie à fluorescence, qui, selon le messager utilisé, émettra une longueur d'onde spécifique de lumière une fois excité. L'immunofluorescence directe, bien qu'un peu moins courante, présente des avantages notables par rapport à la procédure secondaire (indirecte). La fixation directe du messager à l'anticorps réduit le nombre d'étapes de la procédure, ce qui permet de gagner du temps et de réduire le signal de fond non spécifique. Cela limite également la possibilité d'une réactivité croisée des anticorps et d'éventuelles erreurs tout au long du processus. Cependant, certains inconvénients existent dans cette méthode. Étant donné que le nombre de molécules fluorescentes qui peuvent être liées à l'anticorps primaire est limité, l'immunofluorescence directe est sensiblement moins sensible que l'immunofluorescence indirecte et peut entraîner des faux négatifs. L'immunofluorescence directe nécessite également l'utilisation de beaucoup plus d'anticorps primaires, ce qui est extrêmement coûteux, pouvant aller jusqu'à 400,00 $/mL.

Secondaire (indirect)

Un colorant fluorescent pour l' actine dans le muscle lisse de la peau.

L'immunofluorescence secondaire (indirecte) utilise deux anticorps ; le premier anticorps (primaire) non marqué se lie spécifiquement à la molécule cible, et l'anticorps secondaire, qui porte le fluorophore, reconnaît l'anticorps primaire et s'y lie. Plusieurs anticorps secondaires peuvent se lier à un seul anticorps primaire. Cela fournit une amplification du signal en augmentant le nombre de molécules de fluorophore par antigène. Ce protocole est plus complexe et prend plus de temps que le protocole primaire (ou direct) ci-dessus, mais permet plus de flexibilité car une variété d'anticorps secondaires et de techniques de détection différents peuvent être utilisés pour un anticorps primaire donné.

Ce protocole est possible car un anticorps se compose de deux parties, une région variable (qui reconnaît l'antigène) et une région constante (qui constitue la structure de la molécule d'anticorps). Il est important de réaliser que cette division est artificielle et qu'en réalité la molécule d'anticorps est constituée de quatre chaînes polypeptidiques : deux chaînes lourdes et deux chaînes légères. Un chercheur peut générer plusieurs anticorps primaires qui reconnaissent divers antigènes (ont des régions variables différentes), mais partagent tous la même région constante. Tous ces anticorps peuvent donc être reconnus par un seul anticorps secondaire. Cela permet d'économiser le coût de la modification des anticorps primaires pour porter directement un fluorophore.

Différents anticorps primaires avec différentes régions constantes sont généralement générés en augmentant l'anticorps dans différentes espèces. Par exemple, un chercheur peut créer des anticorps primaires chez une chèvre qui reconnaissent plusieurs antigènes, puis utiliser des anticorps secondaires de lapin couplés à un colorant qui reconnaissent la région constante de l'anticorps de chèvre (anticorps de lapin anti-chèvre). Le chercheur peut ensuite créer un deuxième ensemble d'anticorps primaires chez une souris qui pourrait être reconnu par un anticorps secondaire « âne anti-souris » distinct. Cela permet la réutilisation des anticorps couplés à un colorant difficiles à fabriquer dans plusieurs expériences.

Limites

Comme avec la plupart des techniques de fluorescence, un problème important avec l'immunofluorescence est le photoblanchiment . La perte d'activité causée par le photoblanchiment peut être contrôlée en réduisant ou en limitant l'intensité ou la durée d'exposition à la lumière, en augmentant la concentration de fluorophores ou en utilisant des fluorophores plus robustes qui sont moins sujets au blanchiment (par exemple, Alexa Fluors , Seta Fluors , ou DyLight Fluor ). Certains problèmes pouvant découler de cette technique comprennent l'autofluorescence, la fluorescence spécifique indésirable et étrangère et la fluorescence non spécifique. L'autofluorescence comprend la fluorescence émise par le tissu échantillon ou la cellule elle-même. Une fluorescence spécifique indésirable se produit lorsqu'un antigène ciblé est impur et contient des contaminants antigéniques. La fluorescence non spécifique implique la perte de la spécificité d'une sonde en raison d'un fluorophore, d'une fixation incorrecte ou d'un échantillon desséché.

L'immunofluorescence n'est limitée qu'aux cellules fixées (c'est-à-dire mortes) lorsque les structures à l'intérieur de la cellule doivent être visualisées car les anticorps ne pénètrent pas dans la membrane cellulaire lorsqu'ils réagissent avec des marqueurs fluorescents. Le matériel antigénique doit être fixé solidement sur le site de sa localisation naturelle à l'intérieur de la cellule. Les anticorps intacts peuvent également être trop gros pour colorer les cellules cancéreuses in vivo . Leur taille entraîne une pénétration tumorale lente et une longue demi-vie circulante. Des recherches ont été menées pour étudier l'utilisation des diabodies pour contourner cette limitation. Les protéines dans le surnageant ou à l'extérieur de la membrane cellulaire peuvent être liées par les anticorps ; cela permet de colorer les cellules vivantes. Selon le fixateur utilisé, les protéines d'intérêt peuvent devenir réticulées, ce qui peut entraîner des signaux faussement positifs ou faussement négatifs en raison d'une liaison non spécifique.

Une autre approche consiste à utiliser des protéines recombinantes contenant des domaines de protéines fluorescentes, par exemple, la protéine fluorescente verte (GFP). L'utilisation de telles protéines "marquées" permet de déterminer leur localisation dans les cellules vivantes. Même si cela semble être une alternative élégante à l'immunofluorescence, les cellules doivent être transfectées ou transduites avec le tag GFP et, par conséquent, elles deviennent des organismes au moins S1 ou supérieurs qui nécessitent des normes de sécurité plus strictes dans un laboratoire. Cette technique consiste à modifier l'information génétique des cellules.

Avances

De nombreuses améliorations apportées à cette méthode résident dans l'amélioration des microscopes à fluorescence et des fluorophores. Les méthodes de super-résolution font généralement référence à la capacité d'un microscope à produire une résolution inférieure à la limite d'Abbe (une limite placée sur la lumière en raison de sa longueur d'onde). Cette limite de diffraction est d'environ 200-300 nm dans la direction latérale et 500-700 nm dans la direction axiale. Cette limite est comparable ou supérieure à certaines structures de la cellule et, par conséquent, cette limite a empêché les scientifiques de déterminer les détails de leur structure. La super-résolution en fluorescence, plus spécifiquement, fait référence à la capacité d'un microscope à empêcher la fluorescence simultanée de fluorophores adjacents spectralement identiques. Ce processus affine efficacement la fonction d'étalement des points du microscope. Des exemples de méthodes de microscope à fluorescence à super-résolution récemment développées incluent la microscopie à émission stimulée (STED), la microscopie à illumination structurée saturée (SSIM), la microscopie de localisation par photoactivation par fluorescence (FPALM) et la microscopie de reconstruction optique stochastique (STORM).

Voir également

Les références

Liens externes