Diagnostic moléculaire - Molecular diagnostics
Le diagnostic moléculaire est un ensemble de techniques utilisées pour analyser les marqueurs biologiques du génome et du protéome , et comment leurs cellules expriment leurs gènes sous forme de protéines , en appliquant la biologie moléculaire aux tests médicaux . En médecine, la technique est utilisée pour diagnostiquer et surveiller les maladies, détecter les risques et décider quelles thérapies fonctionneront le mieux pour les patients individuels, et en biosécurité agricole de la même manière pour surveiller les maladies des cultures et du bétail , estimer les risques et décider des mesures de quarantaine à prendre. .
En analysant les spécificités du patient et de sa maladie, le diagnostic moléculaire offre la perspective d' une médecine personnalisée . Ces tests sont utiles dans une gamme de spécialités médicales , y compris les maladies infectieuses , l' oncologie , le typage des antigènes leucocytaires humains (qui étudie et prédit la fonction immunitaire ), la coagulation et la pharmacogénomique - la prédiction génétique des médicaments qui fonctionneront le mieux. Ils se chevauchent avec la chimie clinique (tests médicaux sur les fluides corporels).
Histoire
Le domaine de la biologie moléculaire s'est développé à la fin du XXe siècle, tout comme son application clinique. En 1980, Yuet Wai Kan et al . a suggéré un test génétique prénatal pour la thalassémie qui ne reposait pas sur le séquençage de l'ADN - alors à ses débuts - mais sur des enzymes de restriction qui coupaient l'ADN où elles reconnaissaient des séquences courtes spécifiques, créant différentes longueurs de brin d'ADN en fonction de l' allèle (variation génétique) du fœtus possédé. Dans les années 1980, l'expression a été utilisée dans les noms de sociétés telles que Molecular Diagnostics Incorporated et Bethseda Research Laboraties Molecular Diagnostics .
Au cours des années 1990, l'identification de gènes nouvellement découverts et de nouvelles techniques de séquençage de l'ADN ont conduit à l'apparition d'un domaine distinct de la médecine de laboratoire moléculaire et génomique ; en 1995, l' Association for Molecular Pathology (AMP) a été créée pour lui donner une structure. En 1999, l'AMP a cofondé The Journal of Medical Diagnostics . Informa Healthcare a lancé Expert Reviews in Medical Diagnostics en 2001. À partir de 2002, le projet HapMap a rassemblé des informations sur les différences génétiques à une lettre qui se reproduisent dans la population humaine - les polymorphismes nucléotidiques uniques - et leur relation avec la maladie. En 2012, les techniques de diagnostic moléculaire de la thalassémie utilisent des tests d' hybridation génétique pour identifier le polymorphisme spécifique d'un seul nucléotide à l'origine de la maladie d'un individu.
Alors que l'application commerciale des diagnostics moléculaires est devenue plus importante, le débat sur le brevetage des découvertes génétiques en est devenu le cœur . En 1998, l' Union européenne de la directive 98/44 / ECclarified que les brevets sur les séquences d' ADN ont été autorisées. En 2010 aux États-Unis, AMP a poursuivi Myriad Genetics pour contester les brevets de cette dernière concernant deux gènes, BRCA1 , BRCA2 , qui sont associés au cancer du sein. En 2013, la Cour suprême des États-Unis a partiellement accepté , statuant qu'une séquence génétique naturelle ne pouvait pas être brevetée.
Technique
Développement à partir d'outils de recherche
L'industrialisation des outils de dosage de biologie moléculaire a rendu leur utilisation pratique en clinique. La miniaturisation dans un seul appareil portable peut apporter des diagnostics médicaux à la clinique, au bureau ou à la maison. Le laboratoire clinique exige des normes élevées de fiabilité ; les diagnostics peuvent nécessiter une accréditation ou relever de la réglementation relative aux dispositifs médicaux. En 2011, certains laboratoires cliniques américains utilisaient néanmoins des tests vendus à des fins de « recherche uniquement ».
Processus de laboratoire doivent se conformer à la réglementation, comme les modifications cliniques d' amélioration de laboratoire , l' assurance maladie et la portabilité Loi de responsabilité , bonnes pratiques de laboratoire , et Food and Drug Administration des spécifications aux États-Unis. Les systèmes de gestion de l'information de laboratoire aident en suivant ces processus. La réglementation s'applique à la fois au personnel et aux fournitures. En 2012, douze États américains exigent que les pathologistes moléculaires soient agréés; plusieurs conseils tels que l' American Board of Medical Genetics et l' American Board of Pathology certifient les technologues, les superviseurs et les directeurs de laboratoire.
L'automatisation et les codes-barres d'échantillons maximisent le débit et réduisent les risques d'erreur ou de contamination lors de la manipulation manuelle et de la communication des résultats. Des dispositifs uniques pour effectuer le dosage du début à la fin sont désormais disponibles.
Dosages
Le diagnostic moléculaire utilise des tests biologiques in vitro tels que la PCR- ELISA ou l' hybridation in situ par fluorescence . Le test détecte une molécule, souvent à de faibles concentrations, qui est un marqueur de maladie ou de risque dans un échantillon prélevé sur un patient. La conservation de l'échantillon avant l'analyse est critique. Les manipulations manuelles doivent être réduites au minimum. La fragile molécule d' ARN pose certains défis. Dans le cadre du processus cellulaire d'expression des gènes sous forme de protéines, il offre une mesure de l'expression des gènes, mais il est vulnérable à l' hydrolyse et à la dégradation par les enzymes ARNase omniprésentes . Les échantillons peuvent être surgelés dans de l'azote liquide ou incubés dans des agents de conservation.
Étant donné que les méthodes de diagnostic moléculaire peuvent détecter des marqueurs sensibles, ces tests sont moins intrusifs qu'une biopsie traditionnelle . Par exemple, étant donné que des acides nucléiques acellulaires existent dans le plasma humain , un simple échantillon de sang peut suffire pour prélever des informations génétiques sur des tumeurs, des greffes ou un fœtus à naître. De nombreuses méthodes de diagnostic moléculaire basées sur la détection d' acides nucléiques , mais pas toutes, utilisent la réaction en chaîne par polymérase (PCR) pour augmenter considérablement le nombre de molécules d'acide nucléique, amplifiant ainsi la ou les séquences cibles dans l'échantillon du patient. La PCR est une méthode par laquelle un ADN matrice est amplifié à l'aide d'amorces synthétiques, d'une ADN polymérase et de dNTP. Le mélange est cyclé entre au moins 2 températures : une température élevée pour dénaturer l'ADN double brin en molécules simple brin et une température basse pour que l'amorce s'hybride à la matrice et pour que la polymérase étende l'amorce. Chaque cycle de température double théoriquement la quantité de séquence cible. La détection de variations de séquence par PCR implique généralement la conception et l'utilisation de réactifs oligonucléotidiques qui amplifient le variant d'intérêt plus efficacement que la séquence de type sauvage. La PCR est actuellement la méthode la plus utilisée pour la détection de séquences d'ADN. La détection du marqueur peut utiliser la PCR en temps réel, le séquençage direct, les puces microarray — puces préfabriquées qui testent plusieurs marqueurs à la fois, ou MALDI-TOF. Le même principe s'applique au protéome et au génome . Les puces à protéines à haut débit peuvent utiliser de l' ADN ou des anticorps complémentaires pour se lier et peuvent donc détecter de nombreuses protéines différentes en parallèle. Les tests de diagnostic moléculaire varient considérablement en termes de sensibilité, de délai d'exécution, de coût, de couverture et d'approbation réglementaire. Ils varient également dans le niveau de validation appliqué dans les laboratoires qui les utilisent. Par conséquent, une validation locale solide conformément aux exigences réglementaires et l'utilisation de contrôles appropriés sont nécessaires, en particulier lorsque le résultat peut être utilisé pour informer une décision de traitement du patient.
Avantages
Prénatal
Les tests prénataux conventionnels pour les anomalies chromosomiques telles que le syndrome de Down reposent sur l'analyse du nombre et de l'apparence des chromosomes, le caryotype . Les tests de diagnostic moléculaire tels que l'hybridation génomique comparative sur puces à ADN testent plutôt un échantillon d'ADN et, en raison de l'ADN acellulaire dans le plasma, pourraient être moins invasifs, mais à partir de 2013, il s'agit toujours d'un complément aux tests conventionnels.
Traitement
Certains des polymorphismes d'un seul nucléotide d'un patient (de légères différences dans son ADN) peuvent aider à prédire à quelle vitesse ils métaboliseront des médicaments particuliers ; c'est ce qu'on appelle la pharmacogénomique . Par exemple, l'enzyme CYP2C19 métabolise plusieurs médicaments, tels que l'agent anticoagulant Clopidogrel , en leurs formes actives. Certains patients possèdent des polymorphismes à des endroits spécifiques sur le gène 2C19 qui font de mauvais métaboliseurs de ces médicaments ; les médecins peuvent tester ces polymorphismes et déterminer si les médicaments seront pleinement efficaces pour ce patient. Les progrès de la biologie moléculaire ont permis de montrer que certains syndromes qui étaient auparavant classés comme une seule maladie sont en fait de multiples sous-types avec des causes et des traitements totalement différents. Le diagnostic moléculaire peut aider à diagnostiquer le sous-type, par exemple les infections et les cancers, ou l'analyse génétique d'une maladie avec une composante héréditaire, telle que le syndrome de Silver-Russell .
Maladie infectieuse
Les diagnostics moléculaires sont utilisés pour identifier les maladies infectieuses telles que la chlamydia , le virus de la grippe et la tuberculose ; ou des souches spécifiques telles que le virus H1N1 ou le SARS-CoV-2 . L'identification génétique peut être rapide ; par exemple, un test d' amplification isotherme à médiation par boucle diagnostique le parasite du paludisme et est suffisamment robuste pour les pays en développement. Mais malgré ces avancées dans l'analyse du génome, en 2013 les infections sont encore plus souvent identifiées par d'autres moyens : leur protéome, leur bactériophage ou leur profil chromatographique . Les diagnostics moléculaires sont également utilisés pour comprendre la souche spécifique du pathogène, par exemple en détectant les gènes de résistance aux médicaments qu'il possède, et donc les thérapies à éviter. De plus, des tests basés sur le séquençage métagénomique de nouvelle génération peuvent être mis en œuvre pour identifier les organismes pathogènes sans biais.
Gestion du risque de maladie
Le génome d'un patient peut comprendre une mutation héréditaire ou aléatoire qui affecte la probabilité de développer une maladie à l'avenir. Par exemple, le syndrome de Lynch est une maladie génétique qui prédispose les patients aux cancers colorectaux et autres ; une détection précoce peut conduire à une surveillance étroite qui améliore les chances du patient d'obtenir un bon résultat. Le risque cardiovasculaire est indiqué par des marqueurs biologiques et le dépistage peut mesurer le risque qu'un enfant naisse avec une maladie génétique telle que la mucoviscidose . Les tests génétiques sont complexes sur le plan éthique : les patients peuvent ne pas vouloir subir le stress de connaître leur risque. Dans les pays sans soins de santé universels, un risque connu peut augmenter les primes d'assurance.
Cancer
Le cancer est un changement dans les processus cellulaires qui provoque une croissance incontrôlable d'une tumeur. Les cellules cancéreuses présentent parfois des mutations dans des oncogènes , tels que KRAS et CTNNB1 (β-caténine). L'analyse de la signature moléculaire des cellules cancéreuses - l'ADN et ses niveaux d'expression via l'ARN messager - permet aux médecins de caractériser le cancer et de choisir la meilleure thérapie pour leurs patients. Depuis 2010, les tests qui incorporent une gamme d'anticorps contre des molécules marqueurs protéiques spécifiques sont une technologie émergente ; il y a des espoirs pour ces tests multiplex qui pourraient mesurer de nombreux marqueurs à la fois. Parmi les autres biomarqueurs potentiels, citons les molécules de micro-ARN , que les cellules cancéreuses expriment davantage que les cellules saines.
Le cancer est une maladie aux causes moléculaires excessives et en constante évolution. Il existe également une hétérogénéité de la maladie, même chez un individu. Des études moléculaires sur le cancer ont prouvé l'importance des mutations motrices dans la croissance et les métastases des tumeurs. De nombreuses technologies de détection des variations de séquences ont été développées pour la recherche sur le cancer. Ces technologies peuvent généralement être regroupées en trois approches : la réaction en chaîne par polymérase (PCR), l'hybridation et le séquençage de nouvelle génération (NGS). Actuellement, de nombreux tests de PCR et d'hybridation ont été approuvés par la FDA en tant que diagnostics in vitro. Les tests NGS, cependant, sont encore à un stade précoce dans le diagnostic clinique.
Pour effectuer le test de diagnostic moléculaire du cancer, l'un des problèmes importants est la détection de la variation de la séquence d'ADN. Les échantillons de biopsie tumorale utilisés pour le diagnostic contiennent toujours aussi peu que 5 % du variant cible par rapport à la séquence de type sauvage. De plus, pour les applications non invasives à partir du sang périphérique ou de l'urine, le test ADN doit être suffisamment spécifique pour détecter des mutations à des fréquences d'allèles variants inférieures à 0,1 %.
Actuellement, en optimisant la PCR traditionnelle, il existe une nouvelle invention, le système de mutation réfractaire à l'amplification (ARMS) est une méthode de détection des variantes de séquence d'ADN dans le cancer. Le principe derrière ARMS est que l'activité d'extension enzymatique des ADN polymérases est très sensible aux mésappariements près de l'extrémité 3' de l'amorce. De nombreuses entreprises différentes ont développé des tests de diagnostic basés sur les amorces PCR ARMS. Par exemple, Qiagen therascreen, Roche cobas et Biomerieux THxID ont développé des tests PCR approuvés par la FDA pour détecter les mutations du cancer du poumon, du côlon et du mélanome métastatique dans les gènes KRAS, EGFR et BRAF. Leurs kits IVD ont été essentiellement validés sur l'ADN génomique extrait du tissu FFPE.
Il existe également des puces à ADN qui utilisent un mécanisme d'hybridation pour diagnostiquer le cancer. Plus d'un million de sondes différentes peuvent être synthétisées sur une puce avec la technologie Genechip d'Affymetrix avec une limite de détection d'une à dix copies d'ARNm par puits. Les puces à ADN optimisées sont généralement considérées comme produisant une quantification relative répétable de différentes cibles. Actuellement, la FDA a déjà approuvé un certain nombre de tests de diagnostic utilisant des puces à ADN : les tests MammaPrint d'Agendia peuvent informer le risque de récidive du cancer du sein en profilant l'expression de 70 gènes liés au cancer du sein ; Autogénomique Le test INFNITI CYP2C19 peut profiler des polymorphismes génétiques, dont les impacts sur la réponse thérapeutique aux antidépresseurs sont importants ; et CytoScan Dx d'Affymetrix peut évaluer les déficiences intellectuelles et les troubles congénitaux en analysant les mutations chromosomiques.
À l'avenir, les outils de diagnostic du cancer se concentreront probablement sur le séquençage de nouvelle génération (NGS). En utilisant le séquençage de l'ADN et de l'ARN pour diagnostiquer le cancer, la technologie dans le domaine des outils de diagnostic moléculaire se développera mieux. Bien que le débit et le prix du NGS aient été considérablement réduits au cours des 10 dernières années d'environ 100 fois, il nous reste au moins 6 ordres de grandeur loin d'effectuer un séquençage en profondeur au niveau du génome entier. Actuellement, Ion Torrent a développé des panels NGS basés sur AmpliSeq translationnel, par exemple, l'Oncomine Comprehensive Assay. Ils se concentrent sur l'utilisation du séquençage en profondeur des gènes liés au cancer pour détecter des variantes de séquence rares.
L'outil de diagnostic moléculaire peut être utilisé pour l'évaluation du risque de cancer. Par exemple, le test BRCA1/2 de Myriad Genetics évalue le risque à vie de cancer du sein chez les femmes. En outre, certains cancers ne sont pas toujours utilisés avec des symptômes clairs. Il est utile d'analyser les personnes lorsqu'elles ne présentent pas de symptômes évidents et peuvent ainsi détecter le cancer à un stade précoce. Par exemple, le test ColoGuard peut être utilisé pour dépister le cancer colorectal chez les personnes de plus de 55 ans . Le cancer est une maladie à long terme avec diverses étapes de progression, les outils de diagnostic moléculaire peuvent être utilisés pour le pronostic de la progression du cancer. Par exemple, le test OncoType Dx de Genomic Health peut estimer le risque de cancer du sein. Leur technologie peut informer les patientes de rechercher une chimiothérapie si nécessaire en examinant les niveaux d'expression de l'ARN dans les tissus de biopsie du cancer du sein.
Avec le soutien croissant du gouvernement au diagnostic moléculaire de l'ADN, on s'attend à ce qu'un nombre croissant de tests cliniques de détection de l'ADN pour les cancers soient bientôt disponibles. Actuellement, la recherche dans le diagnostic du cancer se développe rapidement avec des objectifs de réduction des coûts, de consommation de temps et de méthodes plus simples pour les médecins et les patients.
Voir également
- Médecine moléculaire (le domaine plus large de la compréhension moléculaire de la maladie)
- Pathologie moléculaire
- Test développé en laboratoire
- Pathogénèse
- Pathogénomique
- Pathologie
- Médecine de précision
- Médecine personnalisée