Conduit de guidage nerveux - Nerve guidance conduit

Un conduit de guidage nerveux (également appelé conduit nerveux artificiel ou greffe nerveuse artificielle , par opposition à une autogreffe ) est un moyen artificiel de guider la repousse axonale pour faciliter la régénération nerveuse et est l'un des nombreux traitements cliniques des lésions nerveuses . Lorsque directe suturer des deux souches d'un nerf sectionné ne peut être accomplie sans tension, le traitement clinique standard pour nerf périphérique blessures est nerf autologue greffe . En raison de la disponibilité limitée du tissu du donneur et de la récupération fonctionnelle dans la greffe nerveuse autologue, la recherche en ingénierie du tissu neural s'est concentrée sur le développement de conduits de guidage nerveux bioartificiels comme traitement alternatif, en particulier pour les gros défauts. Des techniques similaires sont également explorées pour la réparation nerveuse dans la moelle épinière, mais la régénération nerveuse dans le système nerveux central pose un plus grand défi car ses axones ne se régénèrent pas de manière appréciable dans leur environnement natif.

La création de conduits artificiels est également connue sous le nom d' entubation car les extrémités nerveuses et l'espace intermédiaire sont enfermés dans un tube composé de matériaux biologiques ou synthétiques. Que le conduit soit sous la forme d'un tube biologique, d'un tube synthétique ou d'un conduit d'ingénierie tissulaire, il devrait faciliter la communication neurotrope et neurotrophique entre les extrémités proximale et distale de l'espace nerveux, bloquer les facteurs inhibiteurs externes et fournir un guidage physique pour les axones. repousse. L'objectif le plus fondamental d'un conduit de guidage nerveux est de combiner des signaux physiques, chimiques et biologiques dans des conditions qui favoriseront la formation de tissus.

Les matériaux qui ont été utilisés pour fabriquer les tubes biologiques comprennent les vaisseaux sanguins et les muscles squelettiques, tandis que les tubes synthétiques non résorbables et biorésorbables ont été respectivement fabriqués à partir de silicone et de polyglycolide . Les conduits de guidage nerveux issus de l'ingénierie tissulaire sont une combinaison de nombreux éléments : structure d'échafaudage, matériau d'échafaudage, thérapies cellulaires, facteurs neurotrophiques et matériaux biomimétiques . Le choix des signaux physiques, chimiques et biologiques à utiliser est basé sur les propriétés de l'environnement nerveux, qui est essentiel pour créer l'environnement le plus souhaitable pour la régénération axonale. Les facteurs qui contrôlent la sélection des matériaux comprennent la biocompatibilité , la biodégradabilité , l'intégrité mécanique, la contrôlabilité pendant la croissance nerveuse, l'implantation et la stérilisation.

Topographie d'échafaudage

En génie tissulaire , les trois principaux niveaux de structure d'échafaudage sont considérés comme :

la superstructure, la forme générale de l'échafaudage ;
la microstructure, la structure au niveau cellulaire de la surface ; et
la nanostructure, la structure au niveau subcellulaire de la surface.

Superstructure

La superstructure d'un conduit ou d'un échafaudage est importante pour simuler des conditions in vivo pour la formation de tissu nerveux. La matrice extracellulaire, qui est principalement responsable de la direction de la croissance et de la formation des tissus, possède une superstructure complexe créée par de nombreuses molécules fibreuses entrelacées. Les moyens de former une superstructure artificielle comprennent l'utilisation d'hydrogels thermosensibles, de canaux orientés longitudinalement, de fibres orientées longitudinalement, d'axones développés par étirement et d'échafaudages nanofibreux.

Hydrogels thermo-sensibles

Dans les lésions cérébrales traumatiques (TCC), une série d'événements dommageables est initiée qui conduit à la mort cellulaire et à un dysfonctionnement global, qui provoquent la formation d'une cavité lésionnelle de forme irrégulière. La cavité résultante pose de nombreux problèmes pour les échafaudages d'ingénierie tissulaire car une implantation invasive est requise, et souvent l'échafaudage ne se conforme pas à la forme de la cavité. Afin de contourner ces difficultés, les hydrogels thermosensibles ont été conçus pour subir des transitions solution-gélification (sol-gel), qui sont causées par des différences de températures ambiantes et physiologiques, afin de faciliter l'implantation par gélification in situ et la conformation à la forme de la cavité. causé, leur permettant d'être injecté d'une manière peu invasive.

La méthylcellulose (MC) est un matériau avec des transitions sol-gel bien définies dans la plage optimale de températures. La gélification des MC se produit en raison d'une augmentation des interactions hydrophobes intra- et intermoléculaires à mesure que la température augmente. La transition sol-gel est régie par la température critique inférieure de la solution (LCST), qui est la température à laquelle le module d'élasticité est égal au module visqueux. Le LCST ne doit pas dépasser la température physiologique (37 ° C) si l'échafaudage doit se gélifier lors de l'implantation, créant une livraison peu invasive. Après l'implantation dans une cavité de lésion TBI ou un conduit de guidage nerveux périphérique, MC provoque une réponse inflammatoire minimale. Il est également très important pour une administration minimalement invasive que la solution MC ait une viscosité à des températures inférieures à sa LCST, ce qui lui permet d'être injectée à travers une aiguille de petit calibre pour une implantation dans des applications in vivo . Le MC a été utilisé avec succès comme agent d'administration pour les thérapies pharmaceutiques intra-optiques et orales. Certains inconvénients du MC incluent sa propension limitée à l'adsorption des protéines et à l'adhésion cellulaire neuronale, ce qui en fait un hydrogel non bioactif. En raison de ces inconvénients, l'utilisation de MC dans la régénération du tissu neural nécessite la fixation d'un groupe biologiquement actif sur le squelette polymère afin d'améliorer l'adhésion cellulaire.

Un autre gel thermosensible est formé en combinant du chitosane avec du sel de glycérophosphate (GP). Cette solution subit une gélification à des températures supérieures à 37 °C. La gélification du chitosane/GP est plutôt lente, prenant une demi-heure pour durcir initialement et 9 heures de plus pour se stabiliser complètement. La force du gel varie de 67 à 1572 Pa selon la concentration de chitosane ; l'extrémité inférieure de cette plage se rapproche de la rigidité du tissu cérébral. Le chitosan/GP a fait ses preuves in vitro , mais l'ajout de polylysine est nécessaire pour améliorer l'attachement des cellules nerveuses. La polylysine a été liée de manière covalente au chitosane afin d'empêcher sa diffusion. La polylysine a été sélectionnée en raison de sa nature positive et de son caractère hydrophile élevé, qui favorise la croissance des neurites . La survie des neurones a été doublée, bien que l'excroissance des neurites n'ait pas changé avec la polylysine ajoutée.

Canaux orientés longitudinalement

Les canaux orientés longitudinalement sont des structures macroscopiques qui peuvent être ajoutées à un conduit afin de donner aux axones en régénération un guide bien défini pour se développer tout droit le long de l'échafaudage. Dans un échafaudage avec une architecture de canaux microtubulaires , les axones en régénération sont capables de s'étendre à travers des canaux longitudinaux ouverts comme ils le feraient normalement à travers les tubes endoneuraux des nerfs périphériques. De plus, les canaux augmentent la surface disponible pour le contact cellulaire. Les canaux sont généralement créés en insérant une aiguille, un fil ou une seconde solution de polymère dans un échafaudage polymère; après stabilisation de la forme du polymère principal, l'aiguille, le fil ou le deuxième polymère est retiré afin de former les canaux. Généralement, plusieurs canaux sont créés ; cependant, l'échafaudage peut consister en un seul grand canal, qui est simplement un tube creux.

Une technique de moulage a été créée par Wang et al. pour former un conduit de guidage nerveux avec une matrice interne à plusieurs canaux et une paroi de tube externe en chitosane. Dans leur étude de 2006, Wang et al. aiguilles d'acupuncture enfilées à travers un tube creux de chitosane, où elles sont maintenues en place en fixant, à chaque extrémité, des patchs créés à l'aide de la CAO. Une solution de chitosane est ensuite injectée dans le tube et solidifiée, après quoi les aiguilles sont retirées, créant des canaux orientés longitudinalement. Un échafaudage représentatif a ensuite été créé pour la caractérisation avec 21 canaux utilisant des aiguilles d'acupuncture de 400 µm de diamètre. Après examen au microscope, les canaux se sont avérés approximativement circulaires avec de légères irrégularités; tous les canaux étaient alignés avec le diamètre intérieur de la paroi extérieure du tube. Il a été confirmé par imagerie micro-CT que les canaux traversaient toute la longueur de l'échafaudage. Sous l'absorption d'eau, les diamètres intérieur et extérieur de l'échafaudage sont devenus plus grands, mais les diamètres des canaux n'ont pas varié de manière significative, ce qui est nécessaire pour maintenir la forme de l'échafaudage qui guide l'extension des neurites. La structure interne offre une augmentation de la résistance à la compression par rapport à un tube creux seul, ce qui peut empêcher l'effondrement de l'échafaudage sur les neurites en croissance. Les cellules Neuro-2a ont pu se développer sur la matrice interne de l'échafaudage et se sont orientées le long des canaux. Bien que cette méthode n'ait été testée que sur le chitosane, elle peut être adaptée à d'autres matériaux.

Le processus de lyophilisation et de chauffage par fil est une autre méthode de création de canaux orientés longitudinalement, développée par Huang et al. (2005). Une solution de chitosane et d'acide acétique a été congelée autour de fils de nickel-cuivre (Ni-Cu) dans un piège à azote liquide ; par la suite, les fils ont été chauffés et retirés. Les fils Ni-Cu ont été choisis car ils ont un niveau de résistance élevé. Des lyophilisateurs à température contrôlée ont été utilisés pour sublimer l'acide acétique. Il n'y avait aucune preuve que les canaux fusionnent ou se séparent. Après la lyophilisation, les dimensions de l'échafaudage ont diminué, ce qui a rendu les canaux un peu plus petits que le fil utilisé. Les échafaudages ont été neutralisés à une valeur de pH physiologique à l'aide d'une base, qui a eu des effets dramatiques sur la structure poreuse. Des bases plus faibles maintenaient la structure poreuse uniforme, mais une base plus forte la rendait incontrôlable. La technique utilisée ici peut être légèrement modifiée pour s'adapter à d'autres polymères et solvants.

Une autre façon de créer des canaux orientés longitudinalement consiste à créer un conduit à partir d'un polymère avec des fibres orientées longitudinalement intégrées à partir d'un autre polymère ; puis dissoudre sélectivement les fibres pour former des canaux orientés longitudinalement. Des fibres de polycaprolactone (PCL) ont été intégrées dans un échafaudage de (hydroxyéthyl) méthacrylate (HEMA). Le PCL a été préféré au poly (acide lactique) (PLA) et au poly (acide lactique-co-glycolique) (PLGA), car il est insoluble dans l'HEMA mais soluble dans l' acétone . Ceci est important car HEMA a été utilisé pour le matériau du conduit principal et l'acétone a été utilisée pour dissoudre sélectivement les fibres polymères. Des fibres PCL extrudées ont été insérées dans un tube de verre et la solution d'HEMA a été injectée. Le nombre de canaux créés était constant d'un lot à l'autre et les variations de diamètre des fibres pouvaient être réduites en créant un système d'extrusion de fibres PCL plus contrôlé. Les canaux formés ont été confirmés comme continus et homogènes par l'examen des variations de porosité. Ce processus est sûr, reproductible et a des dimensions contrôlables. Dans une étude similaire menée par Yu et Shoichet (2005), HEMA a été copolymérisé avec AEMA pour créer un gel P(HEMA-co-AMEA). Des fibres de polycaprolactone (PCL) ont été incorporées dans le gel, puis dissoutes sélectivement par de l'acétone avec sonication pour créer des canaux. Il a été constaté que l'HEMA en mélange avec 1 % d'AEMA créait les gels les plus résistants. Par rapport aux échafaudages sans canaux, l'ajout de 82 à 132 canaux peut augmenter d'environ 6 à 9 fois la surface, ce qui peut être avantageux pour les études de régénération qui dépendent d'indices médiés par le contact.

Itoh et al. (2003) ont développé un échafaudage constitué d'un seul grand canal orienté longitudinalement qui a été créé à l'aide de tendons de chitosane de crabes. Des tendons ont été récoltés sur des crabes (Macrocheira kaempferi) et lavés à plusieurs reprises avec une solution d'hydroxyde de sodium pour éliminer les protéines et désacétyler la chitine tendineuse , qui devint par la suite connue sous le nom de chitosan tendineux. Une barre en acier inoxydable avec une section transversale de forme triangulaire (de chaque côté 2,1 mm de long) a été insérée dans un tube de chitosane à tendon creux de section transversale de forme circulaire (diamètre : 2 mm ; longueur : 15 mm). En comparant les tubes de forme circulaire et triangulaire, il a été constaté que les tubes triangulaires avaient une résistance mécanique améliorée, conservaient mieux leur forme et augmentaient la surface disponible. Bien qu'il s'agisse d'une méthode efficace pour créer un seul canal, elle ne fournit pas autant de surface pour la croissance cellulaire que les échafaudages multicanaux.

Newman et al. (2006) ont inséré des fibres conductrices et non conductrices dans un échafaudage collagène-TERP (collagène réticulé avec un terpolymère de poly(N-isopropylacrylamide) (PNiPAAm)). Les fibres ont été incorporées en les enveloppant étroitement sur une petite lame de verre et en prenant en sandwich une solution de collagène-TERP entre celle-ci et une autre lame de verre ; des entretoises entre les lames de verre fixent l'épaisseur du gel à 800 µm. Les fibres conductrices étaient de la fibre de carbone et du Kevlar , et les fibres non conductrices étaient du nylon-6 et du fil de tungstène. Les neurites s'étendent dans toutes les directions en faisceaux épais sur la fibre de carbone ; cependant, avec les trois autres fibres, les neurites s'étendaient en fines conformations en forme de toile. Les neurites n'ont montré aucune croissance directionnelle sur les fibres de carbone et de Kevlar, mais ils se sont développés le long des fibres de nylon-6 et dans une certaine mesure le long du fil de tungstène. Les échafaudages en fil de tungstène et en fibre de nylon-6 avaient des neurites se développant dans le gel près de l'interface fibre-gel en plus de se développer le long de la surface. Tous les gels de fibres, à l'exception du Kevlar, ont montré une augmentation significative de l'extension des neurites par rapport aux gels sans fibres. Il n'y avait pas de différence dans l'extension des neurites entre les fibres non conductrices et les fibres conductrices.

Dans leur étude de 2005, Cai et al. ajouté des microfilaments de poly (acide L-lactique) (PLLA) aux tubes creux de poly(acide lactique) (PLA) et de silicium. Les caractéristiques de guidage des microfibres étaient inversement liées au diamètre de la fibre avec des diamètres plus petits favorisant une meilleure migration cellulaire orientée longitudinalement et une régénération axonale. Les microfibres ont également favorisé la myélinisation lors de la réparation des nerfs périphériques.

Axones développés par étirement

Il a été démontré que les faisceaux axonaux matures connaissent une croissance lorsqu'ils sont étirés mécaniquement au niveau de la partie centrale du cylindre axonal. Un tel étirement mécanique a été appliqué par un bioréacteur de croissance axonal personnalisé composé de quatre composants principaux : une chambre d'expansion axonale conçue sur mesure, une table de mouvement linéaire, un moteur pas à pas et un contrôleur. La culture de tissu nerveux est placée dans la chambre d'expansion avec un orifice pour les échanges gazeux et un cadre d'étirement amovible, capable de séparer deux groupes de somas (corps cellulaires des neurones) et ainsi d'étirer leurs axones. Du gel de collagène a été utilisé pour favoriser la croissance de plus gros faisceaux axoniens étirés qui étaient visibles à l'œil nu. Il y a deux raisons à l'amélioration de la croissance due au revêtement de collagène : 1) la culture est devenue hydrophobe après le séchage du collagène, ce qui a permis la croissance d'une concentration plus dense de neurones, et 2) le revêtement de collagène a créé un revêtement non obstrué sur les deux substrats d'allongement . L'examen au microscope électronique à balayage et au MET n'a montré aucun signe d'amincissement des axones dû à l'étirement, et le cytosquelette semblait normal et intact. Les faisceaux d'axones cultivés par étirement ont été cultivés sur une membrane biocompatible, qui pouvait être directement transformée en une structure cylindrique pour la transplantation, éliminant ainsi le besoin de transférer les axones vers un échafaudage une fois la croissance terminée. Les axones développés par étirement ont pu croître à un taux sans précédent de 1 cm/jour après seulement 8 jours d'acclimatation, ce qui est bien supérieur au taux de croissance maximal de 1 mm/jour mesuré pour l'extension du cône de croissance. Le débit de 1 mm/jour est également la vitesse moyenne de transport des éléments structuraux tels que les neurofilaments.

Échafaudages en nanofibres

La recherche sur les fibres nanométriques tente d'imiter l' environnement extracellulaire in vivo afin de favoriser la croissance et la régénération directionnelles. Trois méthodes distinctes pour former des échafaudages nanofibreux sont l'auto-assemblage, la séparation de phases et l'électrofilage. Cependant, il existe de nombreuses autres méthodes pour former des échafaudages nanofibreux.

L'auto-assemblage des échafaudages nanofibreux ne peut se produire que lorsque les fibres elles-mêmes sont conçues pour l'auto-assemblage. Une façon courante de conduire l'auto-assemblage des fibres d'échafaudage consiste à utiliser des peptides amphiphiles de sorte que dans l'eau, la partie hydrophobe entraîne l'auto-assemblage. Une ingénierie soigneusement calculée des peptides amphiphiles permet un contrôle précis de la matrice auto-assemblée. L'auto-assemblage est capable de créer des topographies ordonnées et non ordonnées. Phillips et al. (2005) ont développé et testé in vitro et in vivo une matrice auto-alignée collagène - cellule de Schwann , qui a permis l'alignement de l'extension des neurites DRG in vitro . Les gels de collagène ont été largement utilisés comme substrats pour la culture tissulaire tridimensionnelle . Les cellules sont capables de former des attaches médiées par les intégrines avec le collagène, ce qui initie l'assemblage du cytosquelette et la motilité cellulaire. Lorsque les cellules se déplacent le long des fibres de collagène, elles génèrent des forces qui contractent le gel. Lorsque les fibres de collagène sont attachées aux deux extrémités, les forces générées par les cellules créent une contrainte uniaxiale, provoquant l'alignement des cellules et des fibres de collagène. Les avantages de cette matrice sont sa simplicité et sa rapidité de préparation. La fibronectine plasmatique soluble peut également s'auto-assembler en fibres insolubles stables lorsqu'elle est soumise à un cisaillement mécanique direct dans une solution visqueuse. Phillips et al. (2004) ont étudié une nouvelle méthode d'agrégation par cisaillement qui améliore l'agrégation. Le cisaillement mécanique a été créé en faisant glisser un bolus de 0,2 ml à 3 cm avec une pince ; la fibronectine s'agrège en fibres insolubles à l'interface se déplaçant rapidement dans une cellule d'ultrafiltration. Le mécanisme proposé pour cette agrégation de fibres est l'extension et l'allongement des protéines sous la force de cisaillement mécanique, ce qui conduit à un tassement latéral et à une agrégation de protéines des fibres. Phillips et al. ont montré que le cisaillement mécanique produit en étirant un gel de fibronectine à haute viscosité provoque des changements substantiels dans sa structure et que lorsqu'il est appliqué par extension uniaxiale, un gel de fibronectine visqueux forme des agrégats de fibronectine fibreux orientés ; de plus, les agrégats fibreux ont une solubilité réduite et peuvent supporter les différents types cellulaires in vitro.

La séparation de phases permet de créer des échafaudages de fibres tridimensionnelles submicrométriques sans l'utilisation d'équipement spécialisé. Les cinq étapes impliquées dans la séparation des phases sont la dissolution du polymère, la séparation et la gélification des phases, l'extraction par solvant du gel, la congélation et la lyophilisation dans l'eau. Le produit final est un réseau de fibres continues. La séparation de phases peut être modifiée pour s'adapter à de nombreuses applications différentes, et la structure des pores peut être modifiée en utilisant différents solvants, ce qui peut changer l'ensemble du processus de liquide-liquide à solide-liquide. La porosité et le diamètre des fibres peuvent également être modifiés en faisant varier la concentration initiale du polymère ; une concentration initiale plus élevée conduit à moins de pores et à des diamètres de fibres plus grands. Cette technique peut être utilisée pour créer des réseaux de fibres dont les diamètres atteignent les diamètres des fibres de collagène de type I. Le réseau fibreux créé est orienté de manière aléatoire et jusqu'à présent, aucun travail n'a été effectué pour tenter d'organiser les fibres. La séparation de phases est une technique largement utilisée pour créer facilement des échafaudages nanofibreux hautement poreux.

L'électrofilage fournit une plate-forme robuste pour le développement de conduits synthétiques de guidage nerveux. L'électrofilage peut servir à créer des échafaudages à des dimensions contrôlées avec une chimie et une topographie variables. De plus, différents matériaux peuvent être encapsulés dans des fibres, notamment des particules, des facteurs de croissance et même des cellules. L'électrofilage crée des fibres en chargeant électriquement une gouttelette de polymère fondu ou en solution et en la suspendant à partir d'un capillaire. Ensuite, un champ électrique est appliqué à une extrémité du capillaire jusqu'à ce que la charge dépasse la tension superficielle, créant un jet de polymère qui s'allonge et s'amincit. Ce jet de polymère se décharge sous la forme d'un cône de Taylor, laissant derrière lui des polymères chargés électriquement, qui sont collectés sur une surface mise à la terre en tant que solvant lorsque le solvant s'évapore des jets. Des fibres ont été filées avec des diamètres allant de moins de 3 nm à plus de 1 µm. Le processus est affecté par les paramètres du système tels que le type de polymère, le poids moléculaire du polymère et les propriétés de la solution et par des paramètres de processus tels que le débit, la tension, le diamètre du capillaire, la distance entre le collecteur et le capillaire et le mouvement du collecteur. Le réseau fibreux créé est désordonné et contient un rapport surface/volume élevé en raison d'une porosité élevée ; une grande surface de réseau est idéale pour la croissance et le transport des déchets et des nutriments dans l'ingénierie des tissus neuronaux. Les deux caractéristiques des échafaudages électrofilés qui sont avantageuses pour l'ingénierie des tissus neuronaux sont la morphologie et l'architecture, qui imite étroitement l'ECM, et les pores, qui sont la gamme de tailles correcte qui permet l'échange de nutriments mais empêche la croissance du tissu cicatriciel glial (environ 10 µm). Il a été démontré que les échafaudages PLLA électrofilés aléatoires ont une adhérence cellulaire accrue, ce qui peut être dû à une rugosité de surface accrue. Il a également été démontré que les tapis de fibres électrofilées chimiquement modifiés influencent la différenciation des cellules souches neurales et augmentent la prolifération cellulaire. Au cours de la dernière décennie, les scientifiques ont également développé de nombreuses méthodes de production d'échafaudages de nanofibres alignés, qui servent à fournir des repères topographiques supplémentaires aux cellules. Ceci est avantageux car des échafaudages alignés tridimensionnels à grande échelle ne peuvent pas être créés facilement en utilisant des techniques de fabrication traditionnelles. Dans une étude menée par Yang et al. (2005), des échafaudages microfibreux et nanofibreux poly (acide L-lactique) (PLLA) électrofilés alignés et aléatoires ont été créés, caractérisés et comparés. Les diamètres des fibres étaient directement proportionnels à la concentration initiale en polymère utilisée pour l'électrofilage ; le diamètre moyen des fibres alignées était inférieur à celui des fibres aléatoires dans des conditions de traitement identiques. Il a été montré que les cellules souches neurales s'allongeaient parallèlement aux fibres électrofilées alignées. Les nanofibres alignées avaient une longueur de neurite moyenne plus longue que les microfibres alignées, les microfibres aléatoires et les nanofibres aléatoires. De plus, plus de cellules se sont différenciées sur des nanofibres alignées que sur des microfibres alignées. Ainsi, les résultats de cette étude ont démontré que les nanofibres alignées peuvent être plus bénéfiques que les fibres ou les microfibres non alignées pour favoriser la régénération nerveuse.

Microstructure et nanostructure

La microstructure et la nanostructure, ainsi que la superstructure, sont trois niveaux principaux de structure d'échafaudage qui méritent d'être pris en compte lors de la création d'une topographie d'échafaudage. Alors que la superstructure fait référence à la forme globale de l'échafaudage, la microstructure fait référence à la structure au niveau cellulaire de la surface et la nanostructure fait référence à la structure au niveau subcellulaire de la surface. Les trois niveaux de structure sont capables de provoquer des réponses cellulaires ; Cependant, il existe un intérêt significatif pour la réponse des cellules à la topographie à l'échelle nanométrique motivée par la présence de nombreuses structures à l'échelle nanométrique au sein de la matrice extracellulaire. Il existe un nombre croissant de méthodes de fabrication de micro- et nanostructures (beaucoup provenant de l'industrie des semi-conducteurs) permettant la création de diverses topographies avec une taille, une forme et une chimie contrôlées.

Indices physiques

Les indices physiques sont formés en créant une structure de surface ordonnée au niveau de la microstructure et/ou de la nanostructure. Il a été démontré que les signaux physiques à l'échelle nanométrique modulent l'adhésion cellulaire, la migration, l'orientation, l'inhibition du contact, l'expression des gènes et la formation du cytosquelette. Cela permet la direction des processus cellulaires tels que la prolifération, la différenciation et la propagation. Il existe de nombreuses méthodes pour la fabrication de topographies à l'échelle micro et nanométrique, qui peuvent être divisées en celles qui créent des topographies ordonnées et celles qui créent des topographies non ordonnées.

Les topographies ordonnées sont définies comme des motifs organisés et géométriquement précis. Bien qu'il existe de nombreuses méthodes pour créer des topographies ordonnées, elles prennent généralement beaucoup de temps, nécessitent des compétences et de l'expérience et l'utilisation d'équipements coûteux.

La photolithographie consiste à exposer une source lumineuse à une plaquette de silicium revêtue de résine photosensible ; un masque avec le motif souhaité est placé entre la source lumineuse et la plaquette, permettant ainsi sélectivement à la lumière de filtrer à travers et de créer le motif sur la résine photosensible . Le développement ultérieur de la plaquette fait ressortir le motif dans la résine photosensible. La photolithographie réalisée dans le proche UV est souvent considérée comme la norme pour la fabrication de topographies à l'échelle microscopique. Cependant, comme la limite inférieure de la taille est fonction de la longueur d'onde, cette méthode ne peut pas être utilisée pour créer des caractéristiques à l'échelle nanométrique. Dans leur étude de 2005, Mahoney et al. créé des réseaux organisés decanaux en polyimide (11 µm de hauteur et 20 à 60 µm de largeur) ont été créés sur un substrat de verre par photolithographie. Le polyimide a été utilisé car il adhère bien au verre, est chimiquement stable en solution aqueuse et biocompatible. Il est supposé que les microcanaux ont limité la plage d'angles que les éléments du cytosquelette dans les cônes de croissance des neurites pourraient accumuler, assembler et orienter. Il y avait une diminution significative du nombre de neurites émergeant du soma; cependant, il y avait moins de diminution à mesure que la gamme d'angles sur lesquels les neurites ont émergé a été augmentée. De plus, les neurites étaient en moyenne deux fois plus longs lorsque les neurones étaient cultivés sur les microcanaux par rapport aux témoins sur une surface plane ; cela pourrait être dû à un alignement plus efficace des filaments.

Dans la lithographie par faisceau d'électrons (EBL), une réserve sensible aux électrons est exposée à un faisceau d'électrons à haute énergie. Il y a le choix d'un résist de type positif ou négatif; cependant, une résolution de caractéristique inférieure peut être obtenue avec des résists négatifs. Les motifs sont créés en programmant le faisceau d'électrons pour le chemin exact à suivre le long de la surface du matériau. La résolution est affectée par d'autres facteurs tels que la diffusion des électrons dans la réserve et la rétrodiffusion à partir du substrat. EBL peut créer des caractéristiques de surface unique de l'ordre de 3 à 5 nm. Si plusieurs caractéristiques sont requises sur une grande surface, comme c'est le cas en ingénierie tissulaire, la résolution diminue et les caractéristiques ne peuvent être créées que de 30 à 40 nm, et le développement de la réserve commence à peser plus lourdement sur la formation du motif. Pour empêcher la dissolution de la réserve, une agitation par ultrasons peut être utilisée pour surmonter les forces intermoléculaires. De plus, l'alcool isopropylique (IPA) aide à développer des matrices à haute densité. L'EBL peut devenir un processus plus rapide et moins coûteux en reproduisant des motifs nanométriques dans des matériaux polymères ; le processus de réplication a été démontré avec la polycaprolactone (PCL) en utilisant un gaufrage à chaud et un moulage au solvant . Dans une étude menée par Gomez et al. (2007), il a été démontré que les microcanaux de 1 et 2 µm de large et de 400 et 800 nm de profondeur créés par EBL sur PDMS améliorent la formation d'axones de cellules hippocampiques en culture plus que les signaux chimiques immobilisés.

La lithographie aux rayons X est une autre méthode pour former des motifs ordonnés qui peuvent être utilisés pour étudier le rôle que joue la topographie dans la promotion de la neuritogenèse. Les paramètres du masque déterminent la périodicité du motif, mais la largeur et la profondeur de la crête sont déterminées par les conditions de gravure. Dans une étude, des crêtes ont été créées avec des périodes allant de 400 à 4000 nm, des largeurs allant de 70 à 1900 nm et une profondeur de rainure de 600 nm ; les neurites en développement ont démontré un guidage de contact avec des caractéristiques aussi petites que 70 nm et plus de 90 % des neurites étaient à moins de 10 degrés d'alignement parallèle avec les crêtes et les rainures. Il n'y avait pas de différence significative d'orientation en ce qui concerne les tailles de caractéristiques utilisées. Le nombre de neurites par cellule était limité par les crêtes et les rainures, produisant des phénotypes bipolaires plutôt que ramifiés.

Les topographies non ordonnées sont généralement créées par des processus qui se produisent spontanément au cours d'autres traitements ; les motifs sont aléatoires en termes d'orientation et d'organisation avec un contrôle imprécis ou inexistant sur la géométrie des caractéristiques. L'avantage de créer des topographies non ordonnées par rapport à celles ordonnées est que les processus sont souvent moins longs, moins coûteux et ne nécessitent pas une grande compétence et expérience. Des topographies non ordonnées peuvent être créées par démixion de polymères, lithographie colloïdale et gravure chimique.

Lors de la démixtion des polymères , les mélanges de polymères subissent une séparation de phase spontanée ; il se produit souvent dans des conditions telles que la coulée par centrifugation sur des plaquettes de silicium. Les caractéristiques qui peuvent être créées par cette méthode comprennent des fosses, des îlots et des rubans à l'échelle nanométrique, qui peuvent être contrôlés dans une certaine mesure en ajustant le rapport et la concentration du polymère pour modifier respectivement la forme et la taille des caractéristiques. Il n'y a pas beaucoup de contrôle dans la direction horizontale, bien que la direction verticale des entités puisse être contrôlée avec précision. Parce que le motif est très désordonné horizontalement, cette méthode ne peut être utilisée que pour étudier les interactions cellulaires avec des nanotopographies de hauteur spécifiques .

La lithographie colloïdale est peu coûteuse et peut être utilisée pour créer des surfaces avec des hauteurs et des diamètres contrôlés. Les nanocolliodes sont utilisés comme masque de gravure en les étalant le long de la surface du matériau, puis un bombardement par faisceau d'ions ou une évaporation de film est utilisé pour graver autour des nanocolliodes, créant respectivement des nanocolonnes et des nanopits. La structure de surface finale peut être contrôlée en faisant varier la surface couverte par les colloïdes et la taille des colloïdes. La surface couverte par les colloïdes peut être modifiée en modifiant la force ionique de la solution colloïdale. Cette technique est capable de créer de grandes surfaces à motifs, ce qui est nécessaire pour les applications d'ingénierie tissulaire.

La gravure chimique consiste à tremper la surface du matériau dans un agent de gravure tel que l'acide fluorhydrique (HF) ou l'hydroxyde de sodium (NaOH) jusqu'à ce que la surface soit gravée à la rugosité souhaitée, créée par des piqûres et des saillies à l'échelle nanométrique. Des temps de gravure plus longs conduisent à des surfaces plus rugueuses (c'est-à-dire, des piqûres et des saillies de surface plus petites). Les structures avec une géométrie ou une organisation spécifique ne peuvent pas être créées par cette méthode rudimentaire car elle peut au mieux être considérée comme un traitement de surface pour changer la rugosité de la surface. Les avantages significatifs de cette méthode sont la facilité d'utilisation et le faible coût de création d'une surface avec des nanotopographies . Des plaquettes de silicium ont été gravées à l'aide de HF, et il a été démontré que l'adhésion cellulaire n'était améliorée que dans une plage de rugosité spécifiée (20 à 50 nm).

Indices chimiques

En plus de créer une topographie avec des indices physiques, elle peut être créée avec des indices chimiques en déposant sélectivement une solution de polymère en motifs sur la surface d'un substrat. Il existe différentes méthodes pour déposer les indices chimiques. Deux méthodes de distribution de solutions chimiques comprennent la formation de bandes et la microdistribution piézoélectrique.

Des films polymères à rayures peuvent être formés sur des substrats solides en coulant une solution polymère diluée. Cette méthode est relativement simple, peu coûteuse et n'a aucune restriction sur les matériaux d'échafaudage qui peuvent être utilisés. La procédure implique le chevauchement horizontal des plaques de verre tout en les maintenant séparées verticalement par un espace étroit rempli d'une solution de polymère. La plaque supérieure est déplacée à une vitesse constante entre 60 et 100 µm/s. Un mince film liquide de solution se forme en continu au bord du verre coulissant suite à l'évaporation du solvant. Les motifs de rayures préparés à des vitesses de 60, 70 et 100 µm/s ont créé des espacements de largeur et de rainure de 2,2 et 6,1 µm, 3,6 et 8,4 µm et 4,3 et 12,7 µm, respectivement ; la gamme de hauteurs pour les crêtes était de 50 à 100 nm. Tsuruma, Tanaka et al. ont démontré que des cellules neurales embryonnaires cultivées sur un film recouvert de poly-L-lysine attachées et allongées parallèlement à une solution de poly(ε-caprolactone)/chloroforme (1 g/L) avec des bandes de largeur et d'espacement étroits (largeur : 2,2 µm, espacement : 6,1 µm). Cependant, les neurones se sont développés dans l'axe des motifs avec une large largeur et un espacement (largeur : 4,3 µm, espacement : 12,7 µm). En moyenne, les neurones sur les films à rayures avaient moins de neurites par cellule et des neurites plus longs que les neurones sur les films sans motifs. Ainsi, les paramètres de motif de rayures sont capables de déterminer la direction de croissance, la longueur des neurites et le nombre de neurites par cellule.

La microdistribution a été utilisée pour créer des micromotifs sur des boîtes de culture en polystyrène en distribuant des gouttelettes de solutions de laminine adhésive et d'albumine de sérum bovin (BSA) non adhésive . Le microdistributeur est un élément piézoélectrique attaché à une barre de poussée au-dessus d'un canal gravé dans le silicium, qui a une entrée à chaque extrémité et une buse au milieu. L'élément piézoélectrique se dilate lorsqu'une tension est appliquée, provoquant la distribution de liquide à travers la buse. Le microdistributeur est déplacé à l'aide d'une table xy contrôlée par ordinateur. La résolution du micromotif dépend de nombreux facteurs : la viscosité du liquide distribué, le pas de goutte (la distance entre le centre de deux gouttelettes adjacentes dans une ligne ou un réseau) et le substrat. Avec l'augmentation de la viscosité, les lignes deviennent plus minces, mais si la viscosité du liquide est trop élevée, le liquide ne peut pas être expulsé. Le chauffage de la solution crée des lignées de protéines plus uniformes. Bien qu'un certain chevauchement de gouttelettes soit nécessaire pour créer des lignes continues, une évaporation inégale peut entraîner une concentration de protéines inégale le long des lignes ; cela peut être évité grâce à une évaporation plus douce en modifiant les propriétés de la solution distribuée.

Pour les motifs contenant 0,5 mg/ml de laminine, une proportion plus élevée de neurites s'est développée sur les lignes de microdistribution qu'entre les lignes. Sur des profils de protéines BSA à 10 mg/ml et 1 mg/ml et des profils de protéines BSA sans acides gras, un nombre significatif de neurites évitaient les lignées protéiques et se développaient entre les lignées. Ainsi, les lignées de BSA contenant des acides gras étaient tout aussi non permissives pour la croissance des neurites que les lignées contenant de la BSA avec des acides gras. Parce que la microdistribution ne nécessite pas de contact direct avec les surfaces du substrat, cette technique peut utiliser des surfaces avec une micro- ou nanotopologie délicate qui pourrait être détruite par contact. Il est possible de faire varier la quantité de protéine déposée en distribuant plus ou moins de gouttelettes. Un avantage de la microdistribution est que les motifs peuvent être créés rapidement en 5 à 10 minutes. Étant donné que le microdistributeur piézoélectrique ne nécessite pas de chauffage, des protéines et des fluides thermosensibles ainsi que des cellules vivantes peuvent être distribués.

Matériel d'échafaudage

Le choix du matériau de l'échafaudage est peut-être la décision la plus importante à prendre. Il doit être biocompatible et biodégradable ; en outre, il doit pouvoir incorporer tous les indices physiques, chimiques ou biologiques souhaités, ce qui, dans le cas de certains indices chimiques, signifie qu'il doit disposer d'un site disponible pour lier chimiquement des peptides et d'autres molécules. Les matériaux d'échafaudage choisis pour les conduits de guidage nerveux sont presque toujours des hydrogels. L'hydrogel peut être composé de polymères biologiques ou synthétiques. Les polymères biologiques et synthétiques ont leurs forces et leurs faiblesses. Il est important de noter que le matériau du conduit peut provoquer une récupération inadéquate lorsque (1) les taux de dégradation et de résorption ne correspondent pas au taux de formation des tissus, (2) les propriétés de contrainte-déformation ne se comparent pas bien à celles du tissu neural, (3) lorsqu'un gonflement dégradant se produit, provoquant une déformation importante, (4) une réponse inflammatoire importante est déclenchée, ou (5) le matériau a une faible perméabilité.

Hydrogel

Les hydrogels sont une classe de biomatériaux qui sont des polymères hydrosolubles chimiquement ou physiquement réticulés. Ils peuvent être soit dégradables soit non dégradables selon leur chimie, mais la dégradabilité est plus souhaitable chaque fois que possible. Les hydrogels ont suscité un grand intérêt à des fins d'ingénierie tissulaire, car ils possèdent généralement une biocompatibilité élevée, des propriétés mécaniques similaires à celles des tissus mous et la capacité d'être injectés sous forme de liquide gélifiant. Lorsque les hydrogels sont physiquement réticulés, ils doivent s'appuyer sur une séparation de phases pour la gélification ; la séparation de phases est fonction de la température et réversible. Certains autres avantages des hydrogels sont qu'ils n'utilisent que des solvants aqueux non toxiques, permettent l'infusion de nutriments et la sortie des déchets, et permettent aux cellules de s'assembler spontanément. Les hydrogels ont une faible tension interfaciale, ce qui signifie que les cellules peuvent facilement migrer à travers la limite tissu-implant. Cependant, avec les hydrogels, il est difficile de former une large gamme de propriétés mécaniques ou de structures avec une taille de pores contrôlée.

Polymère synthétique

Un polymère synthétique peut être non dégradable ou dégradable. Aux fins de l'ingénierie des tissus neuronaux, les matériaux dégradables sont préférés dans la mesure du possible, car les effets à long terme tels que l'inflammation et la cicatrice pourraient endommager gravement la fonction nerveuse. La vitesse de dégradation dépend du poids moléculaire du polymère, de sa cristallinité et du rapport des sous-unités d'acide glycolique aux sous-unités d'acide lactique. En raison d'un groupe méthyle , l'acide lactique est plus hydrophobe que l'acide glycolique, ce qui ralentit son hydrolyse. Les polymères synthétiques ont des propriétés mécaniques et des taux de dégradation plus puissants qui peuvent être contrôlés sur une large plage, et ils éliminent le problème d'immunogénicité. Il existe de nombreux polymères synthétiques différents actuellement utilisés dans l'ingénierie des tissus neuronaux. Cependant, les inconvénients de bon nombre de ces polymères comprennent un manque de biocompatibilité et de bioactivité, ce qui empêche ces polymères de favoriser l'attachement, la prolifération et la différenciation cellulaires. Les conduits synthétiques n'ont été cliniquement efficaces que pour la réparation d'espaces de lésions nerveuses très courts de moins de 1 à 2 cm. De plus, la régénération nerveuse avec ces conduits n'a pas encore atteint le niveau de récupération fonctionnelle observé avec les autogreffes nerveuses.

Collagène-terpolymère

Le collagène est un composant majeur de la matrice extracellulaire et se trouve dans les tissus de soutien des nerfs périphériques. Un terpolymère (TERP) a été synthétisé par copolymérisation radicalaire de ses trois monomères et réticulé avec du collagène, créant un échafaudage d'hydrogel biologique-synthétique hybride. Le terpolymère est à base de poly(NIPAAM), qui est connu pour être un polymère respectueux des cellules. TERP est utilisé à la fois comme agent de réticulation pour augmenter la robustesse de l'hydrogel et comme site de greffage de peptides bioactifs ou de facteurs de croissance, en faisant réagir certains de ses groupes acryloxysuccinimide avec les groupes -NH2 sur les peptides ou facteurs de croissance. Parce que l'hydrogel collagène-terpolymère (collagène-TERP) manque d'un composant bioactif, une étude lui a attaché un peptide d'adhésion cellulaire commun trouvé dans la laminine (YIGSR) afin d'améliorer ses propriétés d'adhésion cellulaire.

Famille poly (acide lactique-co-glycolique)

Les polymères de la famille PLGA comprennent le poly (acide lactique) (PLA), le poly (acide glycolique) (PGA) et leur copolymère poly (acide lactique-co-glycolique) (PLGA). Les trois polymères ont été approuvés par la Food and Drug Administration pour être utilisés dans divers dispositifs. Ces polymères sont cassants et ils n'ont pas de régions pour une modification chimique admissible ; de plus, ils se dégradent en vrac plutôt qu'en surface, ce qui n'est pas un processus de dégradation régulier et idéal. Dans une tentative de surmonter le manque de fonctionnalités, des amines libres ont été incorporées dans leurs structures à partir desquelles des peptides peuvent être attachés pour contrôler l'attachement et le comportement des cellules.

Dextrane méthacrylé (Dex-MA) copolymérisé avec du méthacrylate d'aminoéthyle (AEMA)

Le dextran est un polysaccharide dérivé de bactéries; il est généralement produit par les enzymes de certaines souches de leuconostoc ou de streptocoque . Il se compose de résidus de D-glucopyranose liés en α-1,6. Les billes d'hydrogel de dextrane réticulé ont été largement utilisées comme matrices à faible liaison aux protéines pour les applications de chromatographie sur colonne et pour la technologie de culture cellulaire sur microsupport. Cependant, ce n'est que récemment que les hydrogels de dextrane ont été étudiés dans des applications de biomatériaux et spécifiquement comme véhicules d'administration de médicaments. L'un des avantages de l'utilisation du dextrane dans les applications de biomatériaux est sa résistance à l'adsorption des protéines et à l'adhésion cellulaire, ce qui permet de déterminer l'adhésion cellulaire spécifique par des peptides délibérément attachés à partir des composants de l'ECM. AEMA a été copolymérisé avec Dex-MA afin d'introduire des groupes amine primaire pour fournir un site pour la fixation de peptides dérivés de l'ECM pour favoriser l'adhésion cellulaire. Les peptides peuvent être immobilisés en utilisant une chimie de couplage sulfo-SMMC et des peptides à terminaison cysteine. La copolymérisation de Dex-MA avec AEMA a permis de préserver la géométrie macroporeuse des échafaudages en plus de favoriser les interactions cellulaires.

Poly(sébaçate de glycérol) (PGS)

Un nouvel élastomère biodégradable et résistant a été développé à partir de poly(sébaçate de glycérol) (PGS) pour une utilisation dans la création d'un conduit de guidage nerveux. Le PGS a été développé à l'origine à des fins d'ingénierie des tissus mous pour imiter spécifiquement les propriétés mécaniques de l'ECM. Il est considéré comme un élastomère car il est capable de récupérer de la déformation dans des environnements mécaniquement dynamiques et de répartir efficacement les contraintes de manière uniforme dans les tissus en régénération sous forme de microcontraintes. Le PGS est synthétisé par une réaction de polycondensation de glycérol et d'acide sébacique, qui peut être traité à l'état fondu ou traité au solvant dans la forme souhaitée. Le PGS a un module d' Young de 0,28 MPa et une résistance à la traction supérieure à 0,5 MPa. Le nerf périphérique a un module d'Young d'environ 0,45 MPa, très proche de celui du PGS. De plus, le PGS subit une dégradation de surface, accompagnée de pertes de masse linéaire et de résistance lors de la résorption. Après l'implantation, la demi-vie de dégradation a été déterminée à 21 jours; la dégradation complète s'est produite au jour 60. Le PGS subit une absorption d'eau minimale pendant la dégradation et n'a pas de gonflement détectable; le gonflement peut provoquer une distorsion, ce qui rétrécit la lumière tubulaire et peut entraver la régénération. Il est avantageux que le temps de dégradation du PGS puisse être modifié en changeant le degré de réticulation et le rapport de l'acide sébacique au glycérol. Dans une étude de Sundback et al. (2005), les conduits PGS et PLGA implantés avaient des réponses tissulaires précoces similaires ; cependant, les réponses inflammatoires de la PLGA ont augmenté plus tard, tandis que les réponses inflammatoires de la PGS ont continué à diminuer.

Hydrogel de polyéthylène glycol

Les hydrogels de polyéthylène glycol (PEG) sont biocompatibles et il est prouvé qu'ils sont tolérés dans de nombreux types de tissus, y compris le SNC. Mahoney et Anseth ont formé des hydrogels de PEG en photopolymérisant des groupes méthacrylate liés de manière covalente à des macromères de PEG dégradables. La dégradation de l'hydrogel a été surveillée au fil du temps en mesurant la résistance mécanique (module de compression) et la taille moyenne des mailles à partir des données de taux de gonflement. Initialement, les chaînes polymères étaient fortement réticulées, mais au fur et à mesure de la dégradation, les liaisons ester étaient hydrolysées, permettant au gel de gonfler ; le module de compression diminuait à mesure que la taille des mailles augmentait jusqu'à ce que l'hydrogel soit complètement dissous. Il a été démontré que les cellules précurseurs neurales pouvaient être photoencapsulées et cultivées sur les gels PEG avec une mort cellulaire minimale. Parce que la taille des mailles est initialement petite, l'hydrogel bloque les signaux inflammatoires et autres signaux inhibiteurs des tissus environnants. À mesure que la taille des mailles augmente, l'hydrogel est capable de servir d'échafaudage pour la régénération des axones.

Polymères biologiques

Il y a des avantages à utiliser des polymères biologiques par rapport aux polymères synthétiques. Ils sont très susceptibles d'avoir une bonne biocompatibilité et d'être facilement dégradés, car ils sont déjà présents dans la nature sous une forme ou une autre. Cependant, il existe également plusieurs inconvénients. Ils ont des propriétés mécaniques lourdes et des taux de dégradation qui ne peuvent pas être contrôlés sur une large plage. De plus, il existe toujours la possibilité que des matériaux d'origine naturelle provoquent une réponse immunitaire ou contiennent des microbes. Dans la production de matériaux d'origine naturelle, il y aura également des variations d'un lot à l'autre dans les procédures d'isolement à grande échelle qui ne peuvent pas être contrôlées. Certains autres problèmes qui affectent les polymères naturels sont leur incapacité à soutenir la croissance à travers de longs espaces de lésion en raison de la possibilité d'effondrement, de formation de cicatrices et de réabsorption précoce. Malgré tous ces inconvénients, dont certains peuvent être surmontés, les polymères biologiques s'avèrent toujours être le choix optimal dans de nombreuses situations.

Acide polysialique (PSA)

L'acide polysialique (PSA) est un matériau biocompatible et biorésorbable relativement nouveau pour les conduits nerveux artificiels. Il s'agit d'un homopolymère de résidus d'acide sialique liés en 2,8 et d'une modification post-traductionnelle régulée de manière dynamique de la molécule d'adhésion des cellules neuronales (NCAM). Des études récentes ont démontré que le NCAM polysialylé (polySia-NCAM) favorise la régénération du système moteur. Le PSA présente une stabilité dans des conditions de culture cellulaire et permet une dégradation induite par des enzymes. Il a également été découvert récemment que le PSA est impliqué dans des processus de pilotage tels que la neuritogenèse, la recherche du chemin axonal et la migration des neuroblastes. Les animaux atteints de PSA génétiquement invalidés expriment un phénotype mortel, qui n'a pas réussi à trouver le chemin ; les nerfs reliant les deux hémisphères cérébraux étaient aberrants ou manquants. Ainsi, le PSA est vital pour le bon développement du système nerveux.

Collagène Type I/III

Le collagène est le composant majeur de la matrice extracellulaire et a été largement utilisé dans la régénération et la réparation nerveuses. En raison de sa microgéométrie douce et de sa perméabilité, les gels de collagène sont capables de permettre la diffusion de molécules à travers eux. Les taux de résorption du collagène peuvent être contrôlés en réticulant le collagène avec des composés polypoxy. De plus, les échafaudages de collagène de type I/III ont démontré une bonne biocompatibilité et sont capables de favoriser la prolifération des cellules de Schwann. Cependant, les conduits de collagène remplis de cellules de Schwann utilisés pour combler les lacunes nerveuses chez les rats ont montré une régénération nerveuse étonnamment infructueuse par rapport aux autogreffes nerveuses. En effet, la biocompatibilité n'est pas le seul facteur nécessaire à une régénération nerveuse réussie ; d'autres paramètres tels que le diamètre interne, la microtopographie interne, la porosité, l'épaisseur de paroi et la densité d'ensemencement des cellules de Schwann devront être examinés dans des études futures afin d'améliorer les résultats obtenus par ces gels de collagène I/III.

Fibre de soie d'araignée

Il a été démontré que les fibres de soie d'araignée favorisent l'adhésion, la prolifération et la vitalité cellulaires. Allmeling, Jokuszies et al. ont montré que les cellules de Schwann s'attachent rapidement et fermement aux fibres de soie, se développant sous une forme bipolaire ; les taux de prolifération et de survie étaient normaux sur les fibres de soie.

Ils ont utilisé des fibres de soie d'araignée pour créer un conduit nerveux avec des cellules de Schwann et des veines xénogéniques acellulaires. Les cellules de Schwann ont formé des colonnes le long des fibres de soie en peu de temps, et les colonnes étaient similaires aux bandes de Bungner qui se développent in vivo après une lésion du SNP. La soie d'araignée n'a pas été utilisée dans l'ingénierie tissulaire jusqu'à présent en raison de la nature prédatrice des araignées et du faible rendement en soie des araignées individuelles. Il a été découvert que l'espèce Nephila clavipes produit une soie moins immunogène que la soie du ver à soie ; il a une résistance à la traction de 4 x 109 N/m, soit six fois la résistance à la rupture de l'acier. Parce que la soie d'araignée est dégradée protéolytiquement, il n'y a pas de changement de pH par rapport au pH physiologique pendant la dégradation. D'autres avantages de la soie d'araignée incluent sa résistance à la décomposition fongique et bactérienne pendant des semaines et le fait qu'elle ne gonfle pas. De plus, la structure de la soie favorise l'adhésion et la migration cellulaire. Cependant, la récolte de la soie reste une tâche fastidieuse et la composition exacte varie selon les espèces et même entre les individus de la même espèce en fonction du régime alimentaire et de l'environnement. Il y a eu des tentatives pour fabriquer synthétiquement de la soie d'araignée. D'autres études sont nécessaires pour tester la faisabilité de l'utilisation d'un conduit nerveux en soie d'araignée in vitro et in vivo .

Fibroine de soie de ver à soie

En plus des araignées, les vers à soie sont une autre source de soie. La protéine des vers à soie Bombyx mori est un noyau de protéine de fibroïne entourée de séricine, qui est une famille de protéines ressemblant à de la colle. La fibroïne a été caractérisée comme une chaîne lourde avec une séquence hydrophobe et cristallisable répétée : Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-X (X signifie Ser ou Tyr). La séricine environnante est plus hydrophile en raison de nombreux résidus polaires, mais elle a encore quelques portions de feuillet β hydrophobes. Les soies sont utilisées depuis longtemps comme sutures en raison de leur haute résistance mécanique et de leur flexibilité ainsi que de leur perméabilité à l'eau et à l'oxygène. De plus, la fibroïne de soie peut être facilement manipulée et stérilisée. Cependant, l'utilisation de la soie s'est arrêtée lorsque des réactions immunologiques indésirables ont été signalées. Récemment, il a été découvert que la cause des problèmes immunologiques réside uniquement dans la séricine environnante. Depuis cette découverte, la soie sans séricine a été utilisée dans de nombreuses applications pharmaceutiques et biomédicales. Puisqu'il est nécessaire d'enlever la séricine autour de la fibroïne avant que la soie puisse être utilisée, une procédure efficace doit être développée pour son élimination, connue sous le nom de dégommage. Une méthode de dégommage utilise une solution aqueuse bouillante de Na ₂ CO ₃ , qui élimine la séricine sans endommager la fibroïne. Yang, Chen et al. ont démontré que la fibroïne de soie et le fluide d'extrait de fibroïne de soie présentent une bonne biocompatibilité avec les cellules de Schwann, sans effets cytotoxiques sur la prolifération.

Chitosan

Le chitosane et la chitine appartiennent à une famille de biopolymères composés de sous-unités N-acétyl-D-glucosamine et D-glucosamine liées en β(1-4). Le chitosane est formé par N-désacétylation alcaline de la chitine, qui est le deuxième polymère naturel le plus abondant après la cellulose. Le chitosan est un polysaccharide biodégradable qui s'est avéré utile dans de nombreuses applications biomédicales telles qu'un agent chélatant, un support de médicament, une membrane et un additif de traitement de l'eau. Le chitosane est soluble dans les solutions aqueuses diluées, mais précipite en gel à pH neutre. Il ne supporte pas bien l'attachement et la prolifération des cellules neurales, mais peut être amélioré par l'attachement peptidique dérivé de l'ECM. Le chitosan contient également des propriétés mécaniques faibles, qui sont plus difficiles à surmonter.

Le degré d'acétylation (DA) pour le chitosane soluble varie de 0 % à 60 %, selon les conditions de traitement. Une étude a été menée pour caractériser comment la variation de l'AD affecte les propriétés du chitosane. Une DA variable a été obtenue en utilisant l'anhydride acétique ou l'hydrolyse alcaline . Il a été constaté que la diminution de l'acétylation a créé une augmentation de la résistance à la compression. La biodégradation a été examinée à l'aide du lysozyme, qui est connu pour être principalement responsable de la dégradation du chitosane in vivo en hydrolysant ses liaisons glycosidiques et est libéré par les cellules phagocytaires après une lésion nerveuse. Les résultats révèlent qu'il y a eu une perte de masse accélérée avec les DA intermédiaires, par rapport aux DA élevées et faibles au cours de la période étudiée. Lorsque les cellules DRG ont été cultivées sur du chitosane N-acétylé, la viabilité cellulaire a diminué avec l'augmentation de la DA. De plus, le chitosane a une densité de charge croissante avec une diminution de l'AD, ce qui est responsable d'une plus grande adhérence cellulaire. Ainsi, le contrôle de la DA du chitosane est important pour réguler le temps de dégradation. Cette connaissance pourrait aider au développement d'un conduit de guidage nerveux à partir du chitosane.

Aragonite

Il a récemment été démontré que les échafaudages d' aragonite soutiennent la croissance des neurones d'hippocampes de rat. Shany et al. (2006) ont prouvé que les matrices d'aragonite peuvent soutenir la croissance de réseaux astrocytaires in vitro et in vivo . Ainsi, les échafaudages d'aragonite peuvent être utiles pour la réparation et la régénération des tissus nerveux. On émet l'hypothèse que le Ca ²⁺ dérivé de l'aragonite est essentiel pour favoriser l'adhérence cellulaire et le contact cellule-cellule. Ceci est probablement réalisé à l'aide de molécules d'adhésion dépendantes du Ca ²⁺ telles que les cadhérines. Les matrices cristallines d'aragonite présentent de nombreux avantages par rapport aux hydrogels. Ils ont des pores plus grands, ce qui permet une meilleure croissance cellulaire, et le matériau est bioactif en libérant du Ca ²⁺ , ce qui favorise l'adhésion et la survie des cellules. De plus, les matrices d'aragonite ont une résistance mécanique plus élevée que les hydrogels, leur permettant de résister à plus de pression lorsqu'elles sont pressées dans un tissu blessé.

Alginate

L'alginate est un polysaccharide qui forme facilement des chaînes; il peut être réticulé au niveau de ses groupes carboxyliques avec des cations multivalents tels que Cu ²⁺ , Ca ²⁺ ou Al ³⁺ pour former un hydrogel plus stable mécaniquement. Les alginates de calcium forment des polymères à la fois biocompatibles et non immunogènes et ont été utilisés dans des applications d'ingénierie tissulaire. Cependant, ils sont incapables de supporter une croissance orientée longitudinalement, ce qui est nécessaire pour la reconnexion de l'extrémité proximale avec sa cible. Afin de surmonter ce problème, des hydrogels capillaires anisotropes (ACH) ont été développés. Ils sont créés en superposant des solutions aqueuses d'alginate de sodium avec des solutions aqueuses de cations multivalents en couches. Après la formation, les ions électrolytiques diffusent dans les couches de solution de polymère et un processus convectif dissipatif provoque la précipitation des ions, créant des capillaires. Le processus convectif dissipatif résulte de l'opposition des gradients de diffusion et du frottement entre les chaînes polyélectrolytiques. Les parois capillaires sont tapissées d'alginate métallique précipité, tandis que la lumière est remplie d'eau extrudée.

Prang et al. (2006) ont évalué la capacité des gels ACH à favoriser la repousse axonale dirigée dans le SNC des mammifères lésés. Les ions multivalents utilisés pour créer les gels ACH à base d'alginate étaient des ions cuivre, dont la diffusion dans les couches d'alginate de sodium a créé des gels capillaires anisotropes à structure hexagonale. Après précipitation, le gel entier a été traversé par des capillaires orientés longitudinalement. Les échafaudages ACH favorisaient la survie des PNJ adultes et la régénération axonale hautement orientée. C'est le premier cas d'utilisation d'alginates pour produire des gels capillaires structurés anisotropes. Des études futures sont nécessaires pour étudier la stabilité physique à long terme des échafaudages ACH, car la régénération des axones du SNC peut prendre plusieurs mois ; cependant, en plus de pouvoir fournir un support à long terme, les échafaudages doivent également être dégradables. De tous les biopolymères biologiques et synthétiques étudiés par Prang et al. (2006), seuls les gels à base d'agarose étaient comparables à la régénération linéaire causée par les échafaudages ACH. Des études futures devront également déterminer si les échafaudages ACH permettent la réinnervation de la cible in vivo après une lésion de la moelle épinière.

Hydrogel d'acide hyaluronique

L'acide hyaluronique (AH) est un biomatériau largement utilisé en raison de son excellente biocompatibilité et de sa diversité de fonctions physiologiques. Il est abondant dans la matrice extracellulaire (MEC) où il se lie aux gros glycosaminoglycanes (GAG) et aux protéoglycanes par le biais d'interactions spécifiques HA-protéine. HA se lie également aux récepteurs de surface cellulaire tels que CD44, ce qui entraîne l'activation de cascades de signalisation intracellulaires qui régulent l'adhésion et la motilité cellulaires et favorisent la prolifération et la différenciation. Le HA est également connu pour soutenir l'angiogenèse car ses produits de dégradation stimulent la prolifération et la migration des cellules endothéliales. Ainsi, l'AH joue un rôle central dans le maintien des processus normaux nécessaires à la survie des tissus. L'AH non modifié a été utilisé dans des applications cliniques telles que la chirurgie oculaire, la cicatrisation des plaies et la chirurgie plastique. HA peut être réticulé pour former des hydrogels. Des hydrogels HA non modifiés ou modifiés avec de la laminine ont été implantés dans une lésion du système nerveux central adulte et testés pour leur capacité à induire la formation de tissu neural dans une étude de Hou et al. Ils ont démontré leur capacité à soutenir la croissance cellulaire et l'angiogenèse, dans en plus d'inhiber la formation de cicatrices gliales. De plus, les hydrogels HA modifiés avec de la laminine ont pu favoriser l'extension des neurites. Ces résultats soutiennent les gels HA en tant que biomatériau prometteur pour un conduit de guidage nerveux.

Thérapies cellulaires

En plus du matériau d'échafaudage et des signaux physiques, des signaux biologiques peuvent également être incorporés dans un conduit nerveux bioartificiel sous la forme de cellules. Dans le système nerveux, il existe de nombreux types de cellules différentes qui aident à soutenir la croissance et le maintien des neurones. Ces cellules sont collectivement appelées cellules gliales. Les cellules gliales ont été étudiées pour tenter de comprendre les mécanismes derrière leurs capacités à favoriser la régénération axonale. Trois types de cellules gliales sont discutés : les cellules de Schwann, les astrocytes et les cellules engainantes olfactives. En plus des cellules gliales, les cellules souches ont également un avantage potentiel pour la réparation et la régénération, car beaucoup sont capables de se différencier en neurones ou en cellules gliales. Cet article traite brièvement de l'utilisation de cellules souches progénitrices adultes transdifférenciées mésenchymateuses, ectomésenchymateuses, neurales et neurales.

Cellules gliales

Les cellules gliales sont nécessaires pour soutenir la croissance et le maintien des neurones dans le système nerveux périphérique et central. La plupart des cellules gliales sont spécifiques du système nerveux périphérique ou central. Les cellules de Schwann sont situées dans le système nerveux périphérique où elles myélinisent les axones des neurones. Les astrocytes sont spécifiques du système nerveux central ; ils fournissent des nutriments, un soutien physique et une isolation pour les neurones. Ils forment également la barrière hémato-encéphalique. Les cellules engainantes olfactives, cependant, traversent la frontière SNC-SNP, car elles guident les neurones récepteurs olfactifs du SNP au SNC.

Cellules de Schwann

Les cellules de Schwann (SC) sont cruciales pour la régénération des nerfs périphériques ; ils jouent à la fois des rôles structurels et fonctionnels. Les cellules de Schwann sont responsables à la fois de la dégénérescence wallérienne et des bandes de Bungner. Lorsqu'un nerf périphérique est endommagé, les cellules de Schwann modifient leur morphologie, leur comportement et leur prolifération pour s'impliquer dans la dégénérescence wallérienne et les bandes de Bungner. Dans la dégénérescence wallérienne, les cellules de Schwann se développent en colonnes ordonnées le long du tube endoneurial, créant une bande de Bungner (boB) qui protège et préserve le canal endoneurial. De plus, ils libèrent des facteurs neurotrophiques qui améliorent la repousse en conjonction avec les macrophages. Il y a quelques inconvénients à utiliser les cellules de Schwann dans l'ingénierie des tissus neuronaux ; par exemple, il est difficile d'isoler sélectivement les cellules de Schwann et elles présentent une faible prolifération une fois isolées. Une façon de surmonter cette difficulté consiste à induire artificiellement d'autres cellules telles que les cellules souches dans des phénotypes de type SC.

Eguchi et al. (2003) ont étudié l'utilisation des champs magnétiques pour aligner les cellules de Schwann. Ils ont utilisé un aimant supraconducteur de type horizontal, qui produit un champ de 8 T en son centre. Dans les 60 heures suivant l'exposition, les cellules de Schwann se sont alignées parallèlement au champ ; pendant le même intervalle, les cellules de Schwann non exposées se sont orientées de façon aléatoire. Il est supposé que les différences de sensibilité au champ magnétique des composants membranaires et des éléments du cytosquelette peuvent provoquer l'orientation magnétique. Les fibres de collagène ont également été exposées au champ magnétique et, en 2 heures, elles se sont alignées perpendiculairement au champ magnétique, tandis que les fibres de collagène ont formé un motif de maillage aléatoire sans exposition au champ magnétique. Lorsqu'elles sont cultivées sur les fibres de collagène, les cellules de Schwann se sont alignées le long du collagène orienté magnétiquement après deux heures d'exposition au champ magnétique 8-T. En revanche, les cellules de Schwann se sont orientées au hasard sur les fibres de collagène sans exposition au champ magnétique. Ainsi, la culture sur fibres de collagène a permis d'orienter les cellules de Schwann perpendiculairement au champ magnétique et beaucoup plus rapidement.

Ces découvertes peuvent être utiles pour aligner les cellules de Schwann dans une lésion du système nerveux afin de favoriser la formation de bandes de Bungner, qui sont cruciales pour maintenir le tube endoneurial qui guide les axones en croissance vers leurs cibles. Il est presque impossible d'aligner les cellules de Schwann par des techniques physiques externes ; ainsi, la découverte d'une technique alternative pour l'alignement est importante. Cependant, la technique développée a encore ses inconvénients, à savoir qu'il faut une quantité considérable d'énergie pour maintenir le champ magnétique pendant des périodes prolongées.

Des études ont été menées pour tenter d'améliorer la capacité de migration des cellules de Schwann. La migration des cellules de Schwann est régulée par des intégrines avec des molécules d'ECM telles que la fibronectine et la laminine. De plus, la molécule d'adhésion des cellules neuronales ( NCAM ) est connue pour améliorer la motilité des cellules de Schwann in vitro . La NCAM est une glycoprotéine exprimée sur les membranes cellulaires axonales et de Schwann. L'acide polysialique (PSA) est synthétisé sur NCAM par la polysialyltransférase (PST) et la sialyltransférase X (STX). Au cours du développement du SNC, l'expression du PSA sur NCAM est régulée à la hausse jusqu'aux stades postnatals. Cependant, dans le cerveau adulte, le PSA ne se trouve que dans les régions à haute plasticité . L'expression du PSA ne se produit pas sur les cellules de Schwann.

Lavdas et al. (2006) ont étudié si l'expression soutenue du PSA sur les cellules de Schwann améliore leur migration. Les cellules de Schwann ont été transduites avec un vecteur rétroviral codant pour la STX afin d'induire l'expression du PSA. Les cellules de Schwann exprimant le PSA ont obtenu une motilité améliorée, comme le montre un essai de pontage des lacunes et après greffe dans des cultures de tranches de cerveau antérieur postnatales. L'expression du PSA n'a pas modifié la différenciation moléculaire et morphologique. Les cellules de Schwann exprimant le PSA étaient capables de myéliniser les axones du SNC dans des tranches de cervelet, ce qui n'est normalement pas possible in vivo . Il est à espérer que ces cellules de Schwann exprimant le PSA seront capables de migrer dans tout le SNC sans perte de capacités de myélinisation et pourront devenir utiles pour la régénération et la myélinisation des axones dans le système nerveux central.

Astrocytes

Les astrocytes sont des cellules gliales abondantes dans le système nerveux central. Ils sont cruciaux pour le soutien métabolique et trophique des neurones ; de plus, les astrocytes fournissent un tampon ionique et une clairance des neurotransmetteurs. Les axones en croissance sont guidés par des signaux créés par les astrocytes ; ainsi, les astrocytes peuvent réguler l'orientation des neurites et, par la suite, la structuration dans le cerveau en développement. La cicatrice gliale qui se forme après une lésion dans le système nerveux central est formée d'astrocytes et de fibroblastes ; c'est l'obstacle le plus important à la régénération. La cicatrice gliale est constituée d'astrocytes hypertrophiés, de tissu conjonctif et d'ECM. Deux objectifs de l'ingénierie des tissus neuronaux sont de comprendre la fonction des astrocytes et de développer le contrôle de la croissance astrocytaire. Les études de Shany et al. (2006) ont démontré que les taux de survie des astrocytes sont augmentés sur des matrices d'aragonite 3D par rapport aux cultures cellulaires 2D conventionnelles. La capacité des processus cellulaires à s'étendre à travers les courbes et les pores permet la formation de plusieurs couches cellulaires avec des configurations 3D complexes.

Les trois manières distinctes par lesquelles les cellules ont acquis une forme 3D sont :

adhérant à la surface et suivant le contour 3D
étirer certains processus entre 2 courbures
extension des processus en 3D dans les couches cellulaires lorsqu'elles sont situées dans un tissu multicouche

Dans la culture cellulaire conventionnelle, la croissance est limitée à un seul plan, provoquant la formation d'une monocouche avec la plupart des cellules en contact avec la surface ; Cependant, la courbure 3D de la surface de l'aragonite permet à plusieurs couches de se développer et aux astrocytes éloignés les uns des autres de se contacter. Il est important de promouvoir la formation de processus similaire aux conditions 3D in vivo , car la morphologie du processus astrocytaire est essentielle pour guider la directionnalité des axones en régénération. La topographie d'aragonite offre un rapport surface/volume élevé et manque de bords, ce qui conduit à une réduction de l'effet de bord de culture. Les matrices cristallines telles que l'aragonite mentionnée ici sont autorisées pour la promotion d'une formation tissulaire 3D complexe qui se rapproche des conditions in vivo .

Cellules engainantes olfactives

Le système olfactif primaire des mammifères a conservé la capacité de se régénérer en continu à l'âge adulte. Les neurones récepteurs olfactifs ont une durée de vie moyenne de 6 à 8 semaines et doivent donc être remplacés par des cellules différenciées des cellules souches qui se trouvent dans une couche à la base de l'épithélium voisin. Les nouveaux neurones récepteurs olfactifs doivent projeter leurs axones à travers le SNC vers un bulbe olfactif pour être fonctionnels. La croissance axonale est guidée par la composition gliale et la cytoarchitecture du bulbe olfactif en plus de la présence de cellules engainantes olfactives (OEC).

Il est postulé que les OEC proviennent de la placode olfactive , suggérant une origine développementale différente de celle d'autres microglies similaires du système nerveux.

Un autre concept intéressant est que les OEC se trouvent à la fois dans les parties du système nerveux périphérique et central du système olfactif primaire, c'est-à-dire dans l'épithélium et le bulbe olfactifs.

Les OEC sont similaires aux cellules de Schwann en ce qu'elles fournissent une régulation positive du récepteur p75 de faible affinité du NGF après une blessure; cependant, contrairement aux cellules de Schwann, elles produisent des niveaux inférieurs de neurotrophines . Plusieurs études ont montré que les OEC étaient capables de soutenir la régénération des axones lésés, mais ces résultats sont souvent impossibles à reproduire. Quoi qu'il en soit, les OEC ont fait l'objet d'études approfondies en relation avec les lésions de la moelle épinière, la sclérose latérale amyotrophique et d'autres maladies neurodégénératives. Les chercheurs suggèrent que ces cellules possèdent une capacité unique à remyéliniser les neurones blessés.

Les OEC ont des propriétés similaires à celles des astrocytes , qui ont tous deux été identifiés comme étant sensibles à l'infection virale.

Cellules souches

Les cellules souches sont caractérisées par leur capacité à s'auto-renouveler pendant une période prolongée tout en conservant leur capacité à se différencier le long d'une ou plusieurs lignées cellulaires. Les cellules souches peuvent être unipotentes, multipotentes ou pluripotentes, ce qui signifie qu'elles peuvent se différencier en un, plusieurs ou tous les types de cellules, respectivement. Les cellules souches pluripotentes peuvent devenir des cellules dérivées de l'une des trois couches germinales embryonnaires. Les cellules souches ont l'avantage sur les cellules gliales car elles sont capables de proliférer plus facilement en culture. Cependant, il reste difficile de différencier préférentiellement ces cellules en divers types cellulaires de manière ordonnée. Une autre difficulté avec les cellules souches est l'absence d'une définition bien définie des cellules souches au-delà des cellules souches hématopoïétiques (CSH). Chaque « type » de cellules souches a plus d'une méthode pour identifier, isoler et développer les cellules ; cela a causé beaucoup de confusion car toutes les cellules souches d'un « type » (neurales, mésenchymateuses, rétiniennes) ne se comportent pas nécessairement de la même manière dans des conditions identiques.

Cellules souches adultes

Les cellules souches adultes ne sont pas capables de proliférer et de se différencier aussi efficacement in vitro qu'elles le sont in vivo . Les cellules souches adultes peuvent provenir de nombreux emplacements tissulaires différents, mais il est difficile de les isoler car elles sont définies par le comportement et non par des marqueurs de surface. Une méthode reste à développer pour distinguer clairement les cellules souches des cellules différenciées qui les entourent. Cependant, les marqueurs de surface peuvent encore être utilisés dans une certaine mesure pour éliminer la plupart des cellules différenciées indésirables. La plasticité des cellules souches est la capacité de se différencier à travers les limites de la lignée germinale embryonnaire. Cependant, la présence de plasticité a été vivement contestée. Certains prétendent que la plasticité est causée par l'hétérogénéité entre les cellules ou les événements de fusion cellulaire. Actuellement, les cellules peuvent être différenciées entre les lignées cellulaires avec des rendements allant de 10 % à 90 % selon les techniques utilisées. D'autres études doivent être menées afin de standardiser le rendement avec la transdifférenciation. La transdifférenciation des cellules souches multipotentes est un moyen potentiel d'obtenir des cellules souches qui ne sont pas disponibles ou pas facilement obtenues chez l'adulte.

Les cellules souches mésenchymateuses

Les cellules souches mésenchymateuses sont des cellules souches adultes situées dans la moelle osseuse; ils sont capables de se différencier en lignées d'origine mésodermique. Certains exemples de tissus qu'ils forment sont les os , le cartilage , la graisse et les tendons . Les CSM sont obtenues par aspiration de moelle osseuse. De nombreux facteurs favorisent la croissance des CSM, notamment : le facteur de croissance dérivé des plaquettes , le facteur de croissance épidermique et le facteur de croissance analogue à l'insuline-1 . En plus de leurs voies de différenciation normales, les CSM peuvent être transdifférenciées le long de lignées non mésenchymateuses telles que les astrocytes, les neurones et les cellules myélinisantes du SNP. Les CSM sont potentiellement utiles pour les stratégies de régénération nerveuse car :

leur utilisation n'est pas une préoccupation éthique
aucune immunosuppression n'est nécessaire
ils sont une ressource abondante et accessible
ils tolèrent les manipulations génétiques

Keilhoff et al. (2006) ont réalisé une étude comparant la capacité de régénération nerveuse des CSM non différenciées et transdifférenciées aux cellules de Schwann dans des greffes musculaires dévitalisées comblant un espace de 2 cm dans le nerf sciatique de rat. Toutes les cellules étaient autologues. Les CSM transdifférenciées ont été cultivées dans un mélange de facteurs afin de favoriser la formation de cellules de type cellules de Schwann. Les CSM indifférenciées n'ont démontré aucune capacité de régénération, tandis que les CSM transdifférenciées ont montré une certaine capacité de régénération, bien qu'elles n'atteignent pas la capacité des cellules de Schwann.

Cellules souches ectomésenchymateuses

La difficulté d'isoler les cellules de Schwann et d'induire par la suite la prolifération est un obstacle important. Une solution consiste à induire sélectivement des cellules telles que les cellules souches ectomésenchymateuses (EMSC) dans des phénotypes de type cellulaire de Schwann. Les EMSC sont des cellules de la crête neurale qui migrent de la crête neurale crânienne vers le premier arc branchial au cours du développement précoce du système nerveux périphérique. Les EMSC sont multipotentes et possèdent une capacité d'auto-renouvellement. On peut les considérer comme des cellules progénitrices de Schwann car elles sont associées au développement du ganglion de la racine dorsale et du nerf moteur. La différenciation des EMSC semble être régulée par des programmes génétiques intrinsèques et des signaux extracellulaires dans le milieu environnant. Les cellules de Schwann sont à la fois la source de facteurs neurotropes et neurotrophiques essentiels à la régénération des nerfs et un échafaudage pour guider la croissance. Nie, Zhang et al. a mené une étude sur les avantages de la culture des EMSC dans les conduits PLGA. L'ajout de foskoline et de BPE à une culture EMSC a provoqué la formation de processus cellulaires allongés, ce qui est commun aux cellules de Schwann in vitro . Ainsi, la foskoline et le BPF peuvent induire une différenciation en phénotypes de type cellule de Schwann. Le BPE contient les cytokines GDNF , le facteur de croissance basique des fibroblastes et le facteur de croissance dérivé des plaquettes , qui provoquent la différenciation et la prolifération des cellules gliales et de Schwann en activant les MAP kinases . Lorsqu'ils sont implantés dans les conduits PLGA, les EMSC ont maintenu une survie à long terme et favorisé la régénération des nerfs périphériques à travers un espace de 10 mm, ce qui montre généralement peu ou pas de régénération. Des axones myélinisés étaient présents dans les greffons et des lames basales se sont formées dans la myéline. Ces observations suggèrent que les EMSC peuvent favoriser la myélinisation des fibres nerveuses régénérées dans le conduit.

Cellules progénitrices neurales

L'insertion de neurones dans un conduit nerveux bioartificiel semble être la méthode la plus évidente pour remplacer les nerfs endommagés ; cependant, les neurones sont incapables de proliférer et ils sont souvent de courte durée en culture. Ainsi, les cellules progénitrices neurales sont des candidats plus prometteurs pour remplacer les neurones endommagés et dégénérés car elles se renouvellent automatiquement, ce qui permet la production in vitro de nombreuses cellules avec un minimum de matériel donneur. Afin de confirmer que les nouveaux neurones formés à partir de cellules progénitrices neurales font partie d'un réseau fonctionnel, la présence de la formation de synapses est requise. Une étude de Ma, Fitzgerald et al. est la première démonstration de la formation d'une synapse fonctionnelle et d'un réseau neuronal dérivées de cellules souches neurales et progénitrices murines sur une matrice de collagène 3D. Les cellules progénitrices neurales se sont développées et se sont spontanément différenciées en neurones excitables et ont formé des synapses ; en outre, ils ont conservé la capacité de se différencier en trois lignées de tissus neuronaux. Il a également été démontré que non seulement un recyclage actif des vésicules synaptiques se produisait, mais aussi que des connexions excitatrices et inhibitrices capables de générer spontanément des potentiels d'action se formaient. Ainsi, les cellules progénitrices neurales sont une source viable et relativement illimitée pour créer des neurones fonctionnels.

Cellules souches neurales

Les cellules souches neurales (NSC) ont la capacité de s'auto-renouveler et de se différencier en lignées neuronales et gliales. De nombreuses méthodes de culture ont été développées pour diriger la différenciation NSC; Cependant, la création de biomatériaux pour diriger la différenciation des NSC est considérée comme une technologie plus pertinente et utilisable sur le plan clinique. Une approche pour développer un biomatériau pour diriger la différenciation des NSC consiste à combiner des composants de matrice extracellulaire (ECM) et des facteurs de croissance. Une étude très récente de Nakajima, Ishimuro et al. ont examiné les effets de différentes paires moléculaires constituées d'un facteur de croissance et d'un composant ECM sur la différenciation des CSN en astrocytes et cellules neuronales. Les composants de l'ECM étudiés étaient la laminine-1 et la fibronectine, qui sont des composants naturels de l'ECM, et ProNectin F plus (Pro-F) et ProNectin L (Pro-L), qui sont des composants artificiels de l'ECM, et la poly(éthylèneimine) (PEI). Les facteurs neurotrophiques utilisés étaient le facteur de croissance épidermique (EGF), le facteur de croissance des fibroblastes -2 (FGF-2), le facteur de croissance nerveuse (NGF), la neurotrophine-3 (NT-3) et le facteur neurotrophique ciliaire (CNTF). Les combinaisons de paires ont été immobilisées sur des matrices de cellules matricielles, sur lesquelles les NSC ont été cultivées. Après 2 jours de culture, les cellules ont été colorées avec des anticorps contre la nestine , la -tubuline III et la GFAP , qui sont respectivement des marqueurs des NSC, des cellules neuronales et des astrocytes. Les résultats fournissent des informations précieuses sur les combinaisons avantageuses de composants ECM et de facteurs de croissance en tant que méthode pratique pour développer un biomatériau pour diriger la différenciation des NSC.

Facteurs neurotrophiques

Actuellement, les facteurs neurotrophiques sont intensément étudiés pour une utilisation dans les conduits nerveux bioartificiels car ils sont nécessaires in vivo pour diriger la croissance et la régénération des axones. Dans les études, les facteurs neurotrophiques sont normalement utilisés en conjonction avec d'autres techniques telles que les indices biologiques et physiques créés par l'ajout de cellules et de topographies spécifiques. Les facteurs neurotrophiques peuvent ou non être immobilisés sur la structure d'échafaudage, bien que l'immobilisation soit préférée car elle permet la création de gradients permanents et contrôlables. Dans certains cas, tels que les systèmes neuronaux d'administration de médicaments , ils sont immobilisés de manière lâche de sorte qu'ils peuvent être libérés sélectivement à des moments spécifiés et dans des quantités spécifiées. L'administration de médicaments est la prochaine étape au-delà de l'ajout de base de facteurs de croissance aux conduits de guidage nerveux.

Matériaux biomimétiques

De nombreux biomatériaux utilisés pour les conduits de guidage nerveux sont des matériaux biomimétiques . Les matériaux biomimétiques sont des matériaux qui ont été conçus de telle sorte qu'ils provoquent des réponses cellulaires spécifiées médiées par des interactions avec des peptides attachés à l'échafaudage à partir de protéines ECM ; essentiellement, l'incorporation de peptides de liaison cellulaire dans des biomatériaux via une modification chimique ou physique.

Synergisme

La synergie se produit souvent lorsque deux éléments sont combinés; c'est une interaction entre deux éléments qui provoque un effet supérieur aux effets combinés de chaque élément séparément. La synergie est évidente dans la combinaison de matériaux d'échafaudage et de topographie avec des thérapies cellulaires, des facteurs neurotrophiques et des matériaux biomimétiques. L'étude de la synergie est la prochaine étape après que les techniques individuelles se soient avérées efficaces par elles-mêmes. Les combinaisons de ces différents facteurs doivent être soigneusement étudiées afin d'optimiser les effets synergiques.

Optimiser les combinaisons de facteurs neurotrophiques

Il a été émis l'hypothèse que les interactions entre les facteurs neurotrophiques pourraient modifier les concentrations optimales de chaque facteur. Alors que la survie cellulaire et le maintien du phénotype sont importants, l'accent de l'évaluation était sur l'extension des neurites. Une combinaison de NGF , de facteur neurotrophique dérivé de la lignée cellulaire gliale ( GDNF ) et de facteur neurotrophique ciliaire ( CNTF ) a été présentée à des cultures de ganglions de la racine dorsale in vitro . Un facteur de chaque famille neurotrophique a été utilisé. Il a été déterminé qu'il n'y avait pas de différence entre la concentration optimale individuelle et la concentration optimale combinatoire; cependant, vers le jour 5 ou 6, les neurites ont cessé leur extension et ont commencé à se dégrader. Cela a été supposé être dû au manque d'un nutriment critique ou de gradients appropriés; des études antérieures ont montré que les facteurs de croissance sont capables d'optimiser au mieux l'extension des neurites lorsqu'ils sont présentés en gradients. Les futures études sur les combinaisons de facteurs neurotrophiques devront inclure des gradients.

Combinaison de molécules d'adhésion des cellules neurales et de GFD-5

Les molécules d'adhésion cellulaire (CAM) et les facteurs neurotrophiques intégrés dans des matrices biocompatibles sont un concept relativement nouveau à l'étude. Les CAM de la superfamille des immunoglobulines (IgSF), qui comprend L1/NgCAM et la neurofascine, sont particulièrement prometteuses, car elles sont exprimées dans le système nerveux en développement sur les neurones ou les cellules de Schwann. Ils sont connus pour servir d'indices de guidage et de médiation de la différenciation neuronale. Les facteurs neurotrophiques tels que le NGF et le facteur de différenciation de croissance 5 (GDF-5), cependant, sont bien établis en tant que promoteurs de la régénération in vivo . Une étude récente de Niere, Brown et al. étudié les effets synergiques de la combinaison de L1 et de la neurofascine avec le NGF et le GDF-5 sur les neurones DRG en culture ; cette combinaison a amélioré l'excroissance des neurites. Une amélioration supplémentaire a été démontrée en combinant L1 et la neurofascine dans une protéine de fusion artificielle, ce qui améliore l'efficacité puisque les facteurs ne sont pas délivrés individuellement. Non seulement différentes queues peuvent être utilisées, mais elles peuvent même être fusionnées en une seule « nouvelle » queue.

Topographie en synergie avec les indices chimiques et biologiques

L'effet de la présentation de plusieurs types de stimuli tels que des signaux chimiques, physiques et biologiques sur la différenciation des cellules progénitrices neurales n'a pas été exploré. Une étude a été menée dans laquelle trois stimuli différents ont été présentés à des cellules progénitrices d'hippocampe de rat adulte (AHPC) : des astrocytes de type 1 de rat postnatal (biologiques), la laminine (chimique) et un substrat à micromotifs (physique). Plus de 75 % des AHPC alignés à moins de 20° des rainures par rapport à la croissance aléatoire sur les substrats sans motifs. Lorsque les AHPC ont été cultivées sur des substrats à micromotifs avec des astrocytes, l'excroissance a été influencée par les astrocytes qui s'étaient alignés avec les sillons ; à savoir, les AHPC prolongent les processus le long des filaments du cytosquelette astrocytaire. Cependant, l'alignement n'était pas aussi significatif que celui observé par les AHPC en culture seule avec le substrat à micromotifs. Afin d'évaluer les différents phénotypes exprimés à la suite de la différenciation, les cellules ont été colorées avec des anticorps pour la -tubuline de classe III (TuJI), la protéine interagissant avec le récepteur (RIP) et la protéine acide fibrillaire gliale (GFAP), qui sont des marqueurs de neurones précoces, oligodendrocytes et astrocytes, respectivement. La plus grande différenciation a été observée avec les AHPC cultivées sur des substrats à motifs avec des astrocytes.

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