Ribozyme - Ribozyme

Structure 3D d'un ribozyme marteau

Les ribozymes ( ribo acide nucléique en zyme s) sont d' ARN des molécules qui ont la capacité de réactions biochimiques spécifiques de catalyse, y compris l' épissage de l' ARN dans l' expression génique , similaire à l'action des protéines enzymes . La découverte des ribozymes en 1982 a démontré que l'ARN peut être à la fois du matériel génétique (comme l' ADN ) et un catalyseur biologique (comme des enzymes protéiques), et a contribué à l' hypothèse du monde de l' ARN , qui suggère que l'ARN peut avoir joué un rôle important dans l'évolution de l'auto-prébiotique. systèmes de réplication. Les activités les plus courantes des ribozymes naturels ou développés in vitro sont le clivage ou la ligature d'ARN et d'ADN et la formation de liaisons peptidiques. Au sein du ribosome , les ribozymes font partie de la grande sous-unité d'ARN ribosomique pour lier les acides aminés au cours de la synthèse des protéines . Ils participent également à une variété de réactions de traitement de l' ARN , y compris l'épissage de l'ARN , la réplication virale et la biosynthèse de l' ARN de transfert . Des exemples de ribozymes comprennent le ribozyme marteau , le ribozyme VS , le Leadzyme et le ribozyme en épingle à cheveux .

Des chercheurs étudiant l' origine de la vie ont produit en laboratoire des ribozymes capables de catalyser leur propre synthèse à partir de monomères activés dans des conditions très spécifiques, comme un ribozyme d' ARN polymérase . La mutagenèse et la sélection ont été effectuées, ce qui a permis d'isoler des variantes améliorées du ribozyme polymérase "Round-18" de 2001. "B6.61" est capable d'ajouter jusqu'à 20 nucléotides à une matrice d'amorce en 24 heures, jusqu'à ce qu'il se décompose par clivage de ses liaisons phosphodiester. Le ribozyme "tC19Z" peut ajouter jusqu'à 95 nucléotides avec une fidélité de 0,0083 mutations/nucléotide.

Des tentatives ont été faites pour développer des ribozymes en tant qu'agents thérapeutiques, en tant qu'enzymes qui ciblent des séquences d'ARN définies pour le clivage, en tant que biocapteurs et pour des applications dans la génomique fonctionnelle et la découverte de gènes.

Découverte

Schéma montrant le clivage de l'ARN par le ribozyme.

Avant la découverte des ribozymes, les enzymes , qui sont définies comme des protéines catalytiques , étaient les seuls catalyseurs biologiques connus . En 1967, Carl Woese , Francis Crick et Leslie Orgel ont été les premiers à suggérer que l'ARN pourrait agir comme catalyseur. Cette idée était basée sur la découverte que l'ARN peut former des structures secondaires complexes . Ces ribozymes ont été trouvés dans l' intron d'un transcrit d'ARN, qui s'est retiré du transcrit, ainsi que dans le composant ARN du complexe RNase P, qui est impliqué dans la maturation des pré- ARNt . En 1989, Thomas R. Cech et Sidney Altman se sont partagé le prix Nobel de chimie pour leur « découverte des propriétés catalytiques de l'ARN ». Le terme ribozyme a été introduit pour la première fois par Kelly Kruger et al. en 1982 dans un article publié dans Cell .

C'était une croyance fermement établie en biologie que la catalyse était réservée aux protéines. Cependant, l'idée de la catalyse par ARN est motivée en partie par la vieille question concernant l'origine de la vie : laquelle vient en premier, les enzymes qui font le travail de la cellule ou les acides nucléiques qui transportent l'information nécessaire pour produire les enzymes ? Le concept d'"acides ribonucléiques comme catalyseurs" contourne ce problème. L'ARN, par essence, peut être à la fois la poule et l'œuf.

Dans les années 1980, Thomas Cech, à l' Université du Colorado à Boulder , étudiait l'excision d' introns dans un gène d'ARN ribosomique chez Tetrahymena thermophila . En essayant de purifier l'enzyme responsable de la réaction d'épissage, il a découvert que l'intron pouvait être épissé en l'absence de tout extrait cellulaire ajouté. Malgré tous leurs efforts, Cech et ses collègues n'ont pu identifier aucune protéine associée à la réaction d'épissage. Après de nombreux travaux, Cech a proposé que la partie de séquence d'intron de l'ARN puisse rompre et reformer les liaisons phosphodiester . À peu près au même moment, Sidney Altman, professeur à l'Université de Yale , étudiait la façon dont les molécules d'ARNt sont traitées dans la cellule lorsque lui et ses collègues ont isolé une enzyme appelée RNase-P , qui est responsable de la conversion d'un précurseur d' ARNt en ARNt actif. À leur grande surprise, ils ont découvert que la RNase-P contenait de l'ARN en plus des protéines et que l'ARN était un composant essentiel de l'enzyme active. C'était une idée tellement étrangère qu'ils ont eu du mal à publier leurs découvertes. L'année suivante, Altman a démontré que l'ARN peut agir comme un catalyseur en montrant que la sous-unité d'ARN RNase-P pouvait catalyser le clivage de l'ARNt précurseur en ARNt actif en l'absence de tout composant protéique.

Depuis la découverte de Cech et Altman, d'autres chercheurs ont découvert d'autres exemples d'ARN auto-clivant ou de molécules d'ARN catalytique. De nombreux ribozymes ont un centre actif en forme d'épingle à cheveux ou de marteau et une structure secondaire unique qui leur permet de cliver d'autres molécules d'ARN à des séquences spécifiques. Il est maintenant possible de fabriquer des ribozymes qui cliver spécifiquement n'importe quelle molécule d'ARN. Ces catalyseurs d'ARN peuvent avoir des applications pharmaceutiques. Par exemple, un ribozyme a été conçu pour cliver l'ARN du VIH. Si un tel ribozyme était fabriqué par une cellule, toutes les particules virales entrantes verraient leur génome d'ARN clivé par le ribozyme, ce qui empêcherait l'infection.

Structure et mécanisme

Bien qu'ils n'aient que quatre choix pour chaque unité monomère (nucléotides), par rapport aux 20 chaînes latérales d'acides aminés trouvées dans les protéines, les ribozymes ont des structures et des mécanismes divers. Dans de nombreux cas, ils sont capables d'imiter le mécanisme utilisé par leurs homologues protéiques. Par exemple, dans les ARN ribozymes auto-clivants, une réaction SN2 en ligne est effectuée en utilisant le groupe hydroxyle 2' comme nucléophile attaquant le phosphate de pontage et faisant en sorte que l'oxygène 5' de la base N+1 agisse comme groupe partant. En comparaison, la RNase A, une protéine qui catalyse la même réaction, utilise une histidine et une lysine de coordination pour agir comme base pour attaquer le squelette phosphate.

Comme de nombreuses enzymes protéiques, la liaison aux métaux est également essentielle au fonctionnement de nombreux ribozymes. Souvent, ces interactions utilisent à la fois le squelette phosphate et la base du nucléotide, provoquant des changements conformationnels drastiques. Il existe deux classes de mécanismes pour le clivage du squelette phosphodiester en présence de métal. Dans le premier mécanisme, le centre des attaques internes du groupe 2' - OH dans une SN ₂ mécanisme. Les ions métalliques favorisent cette réaction en coordonnant d'abord l'oxygène du phosphate puis en stabilisant l'oxyanion. Le deuxième mécanisme suit également un déplacement SN ₂ , mais le nucléophile provient de l'eau ou de groupes hydroxyles exogènes plutôt que de l'ARN lui-même. Le plus petit ribozyme est UUU, qui peut favoriser le clivage entre G et A du tétranucléotide GAAA via le premier mécanisme en présence de Mn ²⁺ . La raison pour laquelle ce trinucléotide plutôt que le tétramère complémentaire catalyse cette réaction peut être parce que l'appariement UUU-AAA est le trinucléotide le plus faible et le plus flexible parmi les 64 conformations, qui fournit le site de liaison pour Mn2 ⁺ .

Le transfert de phosphoryle peut également être catalysé sans ions métalliques. Par exemple, la ribonucléase A pancréatique et les ribozymes du virus de l'hépatite delta (HDV) peuvent catalyser le clivage du squelette de l'ARN par catalyse acide-base sans ions métalliques. Le ribozyme en épingle à cheveux peut également catalyser l'auto-clivage de l'ARN sans ions métalliques, mais le mécanisme n'est toujours pas clair.

Le ribozyme peut également catalyser la formation d'une liaison peptidique entre les acides aminés adjacents en abaissant l'entropie d'activation.

Image montrant la diversité des structures des ribozymes. De gauche à droite : leadzyme, ribozyme marteau, ribozyme twister

Activités

Un ribosome est une machine biologique qui utilise un ribozyme pour traduire l' ARN en protéines

Bien que les ribozymes soient assez rares dans la plupart des cellules, leurs rôles sont parfois essentiels à la vie. Par exemple, la partie fonctionnelle du ribosome , la machine biologique qui traduit l' ARN en protéines, est fondamentalement un ribozyme, composé de motifs structuraux tertiaires d'ARN qui sont souvent coordonnés à des ions métalliques tels que Mg ^{2+ en} tant que cofacteurs . Dans un système modèle, il n'y a pas besoin de cations divalents dans un ARN à cinq nucléotides catalysant la trans - phénylalanation d'un substrat à quatre nucléotides avec 3 paires de bases complémentaires du catalyseur, où le catalyseur/substrat a été conçu par troncature du ribozyme C3. .

Les ribozymes les mieux étudiés sont probablement ceux qui se coupent eux-mêmes ou d'autres ARN, comme dans la découverte originale de Cech et Altman. Cependant, les ribozymes peuvent être conçus pour catalyser une gamme de réactions (voir ci-dessous), dont beaucoup peuvent se produire dans la vie mais n'ont pas été découvertes dans les cellules.

L'ARN peut catalyser le repliement de la conformation protéique pathologique d'un prion d'une manière similaire à celle d'une chaperonine .

Les ribozymes et l'origine de la vie

L'ARN peut également agir comme une molécule héréditaire, ce qui a encouragé Walter Gilbert à proposer que dans un passé lointain, la cellule utilisait l'ARN à la fois comme matériel génétique et comme molécule structurelle et catalytique plutôt que de diviser ces fonctions entre l' ADN et la protéine comme elles le sont aujourd'hui ; cette hypothèse est connue sous le nom d'« hypothèse du monde de l'ARN » de l' origine de la vie . Étant donné que les nucléotides et l' ARN et donc les ribozymes peuvent provenir de produits chimiques inorganiques, ils sont candidats pour les premières enzymes , et en fait, les premiers "réplicateurs", c'est-à-dire des macromolécules contenant des informations qui se répliquent. Un exemple d'un ribozyme auto-répliquant qui ligature deux substrats pour générer une copie exacte de lui-même a été décrit en 2002. La découverte de l'activité catalytique de l'ARN a résolu le paradoxe « poulet et œuf » de l'origine de la vie, résolvant le problème de l'origine du dogme central des peptides et des acides nucléiques. Selon ce scénario, au tout début de la vie, toute l'activité enzymatique et le codage de l'information génétique étaient effectués par une seule molécule, l'ARN.

Ribozymes artificiels

Depuis la découverte des ribozymes qui existent dans les organismes vivants, il y a eu un intérêt pour l'étude de nouveaux ribozymes synthétiques fabriqués en laboratoire. Par exemple, des ARN auto-clivants produits artificiellement qui ont une bonne activité enzymatique ont été produits. Tang et Breaker ont isolé des ARN auto-clivants par sélection in vitro d'ARN provenant d'ARN à séquence aléatoire. Certains des ribozymes synthétiques produits avaient de nouvelles structures, tandis que d'autres étaient similaires au ribozyme en tête de marteau d'origine naturelle. En 2015, des chercheurs de l'Université Northwestern et de l' Université de l'Illinois à Chicago ont conçu un ribosome captif qui fonctionne presque aussi bien que le composant cellulaire authentique qui produit toutes les protéines et enzymes dans la cellule. Appelé Ribosome-T ou Ribo-T, le ribosome artificiel a été créé par Michael Jewett et Alexander Mankin. Les techniques utilisées pour créer des ribozymes artificiels impliquent une évolution dirigée. Cette approche tire parti de la double nature de l'ARN en tant que catalyseur et polymère informationnel, ce qui permet à un chercheur de produire facilement de vastes populations de catalyseurs d'ARN à l'aide d' enzymes polymérases . Les ribozymes sont mutés par transcription inverse avec une transcriptase inverse dans divers ADNc et amplifiés avec une PCR sujette aux erreurs . Les paramètres de sélection dans ces expériences diffèrent souvent. Une approche pour sélectionner un ribozyme de ligase consiste à utiliser des marqueurs de biotine , qui sont liés de manière covalente au substrat. Si une molécule possède l' activité ligase souhaitée , une matrice de streptavidine peut être utilisée pour récupérer les molécules actives.

Lincoln et Joyce ont développé un système enzymatique à ARN capable de s'auto-répliquer en une heure environ. En utilisant la compétition moléculaire ( évolution in vitro ) d'un mélange d'ARN candidat, une paire de ribozymes a émergé, dans laquelle chacun synthétise l'autre en joignant des oligonucléotides synthétiques, sans protéine présente.

Bien qu'il ne s'agisse pas de véritables catalyseurs, la création de riboswitchs artificiels auto-clivants, appelés aptazymes, a également été un domaine de recherche actif. Les riboswitches sont des motifs d'ARN régulateurs qui modifient leur structure en réponse à un petit ligand moléculaire pour réguler la traduction. Bien qu'il existe de nombreux riboswitchs naturels connus qui se lient à un large éventail de métabolites et d'autres petites molécules organiques, un seul ribozyme basé sur un riboswitch a été décrit, glmS . Les premiers travaux de caractérisation des riboswitchs auto-clivants se sont concentrés sur l'utilisation de la théophylline comme ligand. Dans ces études, une épingle à cheveux d'ARN est formée qui bloque le site de liaison du ribosome , inhibant ainsi la traduction. En présence du ligand , dans ces cas la théophylline, la région d'ARN régulatrice est clivée, permettant au ribosome de se lier et de traduire le gène cible. Une grande partie de ce travail d'ingénierie de l'ARN était basée sur une conception rationnelle et des structures d'ARN préalablement déterminées plutôt que sur une évolution dirigée comme dans les exemples ci-dessus. Des travaux plus récents ont élargi les ligands utilisés dans les ribozymes riboswitches pour inclure le pyrophosphate de thymine (2). Le tri cellulaire activé par fluorescence a également été utilisé pour concevoir des aptazymes.

ARN polymérase ribozyme

On pense que la vie moderne, basée en grande partie sur l' ADN comme matériel génétique, est issue d'organismes à base d'ARN dans un monde d'ARN antérieur . La vie de l'ARN aurait dépendu d'un ribozyme d' ARN polymérase ARN-dépendant pour copier des molécules d'ARN fonctionnelles, y compris la copie de la polymérase elle-même. Tjhung et al. ont obtenu un ribozyme d'ARN polymérase par évolution in vitro qui a un niveau d'activité sans précédent dans la copie de molécules d'ARN complexes. Cependant, ce ribozyme est incapable de se copier et ses produits d'ARN ont un taux de mutation élevé . Néanmoins, des progrès continuent d'être réalisés vers l'objectif d'obtenir, par évolution in vitro , un ribozyme d'ARN polymérase autoreproducteur précis et efficace afin d'améliorer la compréhension de l'évolution précoce de la vie.

Samanta et Joyce ont découvert qu'un ribozyme d'ARN polymérase hautement évolué était capable de fonctionner comme une transcriptase inverse , c'est-à-dire qu'il pouvait synthétiser une copie d'ADN à l'aide d'une matrice d'ARN. Une telle activité est considérée comme cruciale pour la transition des génomes à ARN à ADN au début de l'histoire de la vie sur terre. La capacité de transcription inverse pourrait avoir surgi en tant que fonction secondaire d'un ribozyme d'ARN polymérase ARN-dépendant précoce.

Applications

Les ribozymes ont été proposés et développés pour le traitement de maladies par thérapie génique (3). L'un des principaux défis de l'utilisation d'enzymes à base d'ARN en tant que thérapeutique est la courte demi-vie des molécules d'ARN catalytiques dans le corps. Pour lutter contre cela, la position 2' sur le ribose est modifiée pour améliorer la stabilité de l'ARN. Un domaine de la thérapie génique par ribozyme a été l'inhibition des virus à base d'ARN.

Un type de ribozyme synthétique dirigé contre l' ARN du VIH appelé cisaillement de gène a été développé et a fait l'objet d'essais cliniques pour l'infection par le VIH.

De même, les ribozymes ont été conçus pour cibler l'ARN du virus de l'hépatite C, le coronavirus du SRAS (SARS-CoV), l'adénovirus et l'ARN des virus de la grippe A et B. Le ribozyme est capable de cliver les régions conservées du génome du virus, ce qui s'est avéré réduire le virus en culture cellulaire de mammifère. Malgré ces efforts des chercheurs, ces projets sont restés au stade préclinique.

Ribozymes connus

Classes de ribozymes naturels bien validées :

Voir également

Notes et références

Lectures complémentaires

Liens externes

• Courte conférence de Tom Cech : "À la découverte des ribozymes"