Cristallographie aux rayons X - X-ray crystallography

Un diffractomètre à rayons X sur poudre en mouvement

Cristallographie aux rayons X ( XRC ) est la science expérimentale détermination de la structure atomique et moléculaire d'un cristal , dans lequel la structure cristalline provoque un faisceau d'incident de rayons X à diffractent dans de nombreuses directions spécifiques. En mesurant les angles et les intensités de ces faisceaux diffractés, un cristallographe peut produire une image tridimensionnelle de la densité d' électrons dans le cristal. A partir de cette densité électronique , les positions moyennes des atomes dans le cristal peuvent être déterminées, ainsi que leurs liaisons chimiques , leur désordre cristallographique , et diverses autres informations.

Étant donné que de nombreux matériaux peuvent former des cristaux, tels que des sels , des métaux , des minéraux , des semi - conducteurs , ainsi que diverses molécules inorganiques, organiques et biologiques, la cristallographie aux rayons X a été fondamentale dans le développement de nombreux domaines scientifiques. Au cours de ses premières décennies d'utilisation, cette méthode a déterminé la taille des atomes, les longueurs et les types de liaisons chimiques, ainsi que les différences à l'échelle atomique entre divers matériaux, en particulier les minéraux et les alliages . La méthode a également révélé la structure et la fonction de nombreuses molécules biologiques, notamment des vitamines , des médicaments, des protéines et des acides nucléiques tels que l' ADN . La cristallographie aux rayons X est toujours la principale méthode pour caractériser la structure atomique de nouveaux matériaux et pour discerner les matériaux qui semblent similaires par d'autres expériences . Les structures cristallines aux rayons X peuvent également expliquer les propriétés électroniques ou élastiques inhabituelles d'un matériau, faire la lumière sur les interactions et les processus chimiques, ou servir de base à la conception de produits pharmaceutiques contre les maladies .

Dans une mesure de diffraction des rayons X sur monocristal, un cristal est monté sur un goniomètre . Le goniomètre est utilisé pour positionner le cristal à des orientations sélectionnées. Le cristal est illuminé par un faisceau monochromatique finement focalisé de rayons X, produisant un motif de diffraction de points régulièrement espacés appelés réflexions . Les images bidimensionnelles prises à différentes orientations sont converties en un modèle tridimensionnel de la densité d'électrons au sein du cristal en utilisant la méthode mathématique des transformées de Fourier , combinée avec des données chimiques connues pour l'échantillon. Une mauvaise résolution (flou) ou même des erreurs peuvent survenir si les cristaux sont trop petits ou pas assez uniformes dans leur composition interne.

La cristallographie aux rayons X est liée à plusieurs autres méthodes de détermination des structures atomiques. Des diagrammes de diffraction similaires peuvent être produits en diffusant des électrons ou des neutrons , qui sont également interprétés par transformation de Fourier . Si des monocristaux de taille suffisante ne peuvent pas être obtenus, diverses autres méthodes aux rayons X peuvent être appliquées pour obtenir des informations moins détaillées ; de tels procédés comprennent la diffraction de fibre , diffraction de poudre et (si l'échantillon n'a pas été cristallisé) à petit angle de diffusion de rayons X (SAXS). Si le matériau à l'étude n'est disponible que sous forme de poudres nanocristallines ou souffre d'une mauvaise cristallinité, les méthodes de cristallographie électronique peuvent être appliquées pour déterminer la structure atomique.

Pour toutes les méthodes de diffraction des rayons X mentionnées ci-dessus, la diffusion est élastique ; les rayons X diffusés ont la même longueur d' onde que les rayons X entrants. En revanche, les méthodes de diffusion inélastique des rayons X sont utiles pour étudier les excitations de l'échantillon telles que les plasmons , les champs cristallins et les excitations orbitales, les magnons et les phonons , plutôt que la distribution de ses atomes.

Histoire

Début de l'histoire scientifique des cristaux et des rayons X

Dessin d'emballage carré (figure A, ci-dessus) et hexagonal (figure B, ci-dessous) d'après l' œuvre de Kepler , Strena seu de Nive Sexangula .

Les cristaux, bien que longtemps admirés pour leur régularité et leur symétrie, n'ont été étudiés scientifiquement qu'au XVIIe siècle. Johannes Kepler a émis l'hypothèse dans son ouvrage Strena seu de Nive Sexangula (Un cadeau du nouvel an de neige hexagonale) (1611) que la symétrie hexagonale des cristaux de flocon de neige était due à un emballage régulier de particules d'eau sphériques.

Comme le montre la cristallographie aux rayons X, la symétrie hexagonale des flocons de neige résulte de la disposition tétraédrique des liaisons hydrogène autour de chaque molécule d'eau. Les molécules d'eau sont disposées de la même manière que les atomes de silicium dans le polymorphe tridymite de SiO 2 . La structure cristalline résultante a une symétrie hexagonale lorsqu'elle est vue le long d'un axe principal.

Le scientifique danois Nicolas Steno (1669) a été le pionnier des recherches expérimentales sur la symétrie cristalline. Steno a montré que les angles entre les faces sont les mêmes dans chaque exemplaire d'un type particulier de cristal, et René Just Haüy (1784) a découvert que chaque face d'un cristal peut être décrite par de simples motifs d'empilement de blocs de même forme et taille . Ainsi, William Hallowes Miller en 1839 a pu donner à chaque face une étiquette unique de trois petits nombres entiers, les indices de Miller qui restent utilisés aujourd'hui pour identifier les faces cristallines. L'étude de Haüy a conduit à l'idée correcte que les cristaux sont un réseau tridimensionnel régulier (un réseau de Bravais ) d'atomes et de molécules ; une même maille élémentaire se répète indéfiniment selon trois directions principales qui ne sont pas nécessairement perpendiculaires. Au XIXe siècle, un catalogue complet des symétries possibles d'un cristal a été élaboré par Johan Hessel , Auguste Bravais , Evgraf Fedorov , Arthur Schönflies et (tardivement) William Barlow (1894). À partir des données disponibles et du raisonnement physique, Barlow a proposé plusieurs structures cristallines dans les années 1880 qui ont été validées plus tard par cristallographie aux rayons X ; cependant, les données disponibles étaient trop rares dans les années 1880 pour accepter ses modèles comme concluants.

La cristallographie aux rayons X montre l'arrangement des molécules d'eau dans la glace, révélant les liaisons hydrogène (1) qui maintiennent le solide ensemble. Peu d'autres méthodes peuvent déterminer la structure de la matière avec une telle précision ( résolution ).

Wilhelm Röntgen a découvert les rayons X en 1895, juste au moment où les études de la symétrie cristalline étaient terminées. Les physiciens n'étaient pas certains de la nature des rayons X, mais ils soupçonnèrent bientôt qu'il s'agissait d'ondes de rayonnement électromagnétique , une forme de lumière . La théorie de Maxwell du rayonnement électromagnétique était bien acceptée par les scientifiques et les expériences de Charles Glover Barkla ont montré que les rayons X présentaient des phénomènes associés aux ondes électromagnétiques, notamment une polarisation transversale et des raies spectrales similaires à celles observées dans les longueurs d'onde visibles. Des expériences à fente unique dans le laboratoire d' Arnold Sommerfeld ont suggéré que les rayons X avaient une longueur d' onde d'environ 1 angström . Les rayons X ne sont pas seulement des ondes, mais aussi des photons et ont des propriétés particulaires. Albert Einstein a introduit le concept de photon en 1905, mais il n'a été largement accepté qu'en 1922, lorsqu'Arthur Compton l'a confirmé par la diffusion des rayons X des électrons. Les propriétés particulaires des rayons X, telles que leur ionisation des gaz, avaient incité William Henry Bragg à affirmer en 1907 que les rayons X n'étaient pas un rayonnement électromagnétique. Le point de vue de Bragg s'est avéré impopulaire et l'observation de la diffraction des rayons X par Max von Laue en 1912 a confirmé pour la plupart des scientifiques que les rayons X sont une forme de rayonnement électromagnétique.

Diffraction des rayons X

Le faisceau entrant (venant du coin supérieur gauche) amène chaque diffuseur à re-rayonner une petite partie de son intensité sous la forme d'une onde sphérique. Si les diffuseurs sont disposés symétriquement avec une séparation d , ces ondes sphériques ne seront synchronisées (additionnées de manière constructive) que dans les directions où leur différence de longueur de trajet 2 d sin est égale à un multiple entier de la longueur d'onde . Dans ce cas, une partie du faisceau entrant est déviée d'un angle 2θ, produisant une tache de réflexion dans le diagramme de diffraction .

Les cristaux sont des réseaux réguliers d'atomes, et les rayons X peuvent être considérés comme des ondes de rayonnement électromagnétique. Les atomes diffusent des ondes de rayons X, principalement à travers les électrons des atomes. Tout comme une vague océanique frappant un phare produit des ondes circulaires secondaires émanant du phare, de même un rayon X frappant un électron produit des ondes sphériques secondaires émanant de l'électron. Ce phénomène est connu sous le nom de diffusion élastique , et l'électron (ou phare) est connu sous le nom de diffuseur . Un réseau régulier de diffuseurs produit un réseau régulier d'ondes sphériques. Bien que ces ondes s'annulent dans la plupart des directions par interférence destructive , elles s'ajoutent de manière constructive dans quelques directions spécifiques, déterminées par la loi de Bragg :

Ici, d est l'espacement entre les plans de diffraction, est l'angle d'incidence, n est un nombre entier et est la longueur d'onde du faisceau. Ces directions spécifiques apparaissent sous forme de taches sur le motif de diffraction appelées réflexions . Ainsi, la diffraction des rayons X résulte d'une onde électromagnétique (le rayon X) frappant un réseau régulier de diffuseurs (l'arrangement répété des atomes dans le cristal).

Les rayons X sont utilisés pour produire le diagramme de diffraction car leur longueur d'onde λ est généralement du même ordre de grandeur (1 à 100 angströms) que l'espacement d entre les plans du cristal. En principe, toute onde frappant un réseau régulier de diffuseurs produit une diffraction , comme l'avait prédit Francesco Maria Grimaldi en 1665. Pour produire une diffraction significative, l'espacement entre les diffuseurs et la longueur d'onde de l'onde incidente doit être de taille similaire. À titre d'illustration, la diffraction de la lumière du soleil à travers une plume d'oiseau a été signalée pour la première fois par James Gregory à la fin du XVIIe siècle. Les premiers réseaux de diffraction artificiels pour la lumière visible ont été construits par David Rittenhouse en 1787 et Joseph von Fraunhofer en 1821. Cependant, la lumière visible a une longueur d'onde trop longue (généralement 5 500 angströms) pour observer la diffraction des cristaux. Avant les premières expériences de diffraction des rayons X, les espacements entre les plans du réseau dans un cristal n'étaient pas connus avec certitude.

L'idée que les cristaux pourraient être utilisés comme réseau de diffraction pour les rayons X est née en 1912 lors d'une conversation entre Paul Peter Ewald et Max von Laue dans le jardin anglais de Munich . Ewald avait proposé un modèle de résonateur de cristaux pour sa thèse, mais ce modèle n'a pas pu être validé en utilisant la lumière visible , car la longueur d'onde était beaucoup plus grande que l'espacement entre les résonateurs. Von Laue s'est rendu compte qu'un rayonnement électromagnétique d'une longueur d'onde plus courte était nécessaire pour observer de si petits espacements, et a suggéré que les rayons X pourraient avoir une longueur d'onde comparable à l'espacement des cellules unitaires dans les cristaux. Von Laue a travaillé avec deux techniciens, Walter Friedrich et son assistant Paul Knipping, pour faire briller un faisceau de rayons X à travers un cristal de sulfate de cuivre et enregistrer sa diffraction sur une plaque photographique . Après avoir été développée, la plaque montrait un grand nombre de taches bien définies disposées selon un motif de cercles sécants autour de la tache produite par le faisceau central. Von Laue a développé une loi qui relie les angles de diffusion et la taille et l'orientation des espacements des cellules unitaires dans le cristal, pour laquelle il a reçu le prix Nobel de physique en 1914.

Diffusion

Comme décrit dans la dérivation mathématique ci - dessous , la diffusion des rayons X est déterminée par la densité d'électrons dans le cristal. Puisque l'énergie d'un rayon X est beaucoup plus grande que celle d'un électron de valence, la diffusion peut être modélisée comme la diffusion Thomson , l'interaction d'un rayon électromagnétique avec un électron libre. Ce modèle est généralement adopté pour décrire la polarisation du rayonnement diffusé.

L'intensité de la diffusion Thomson pour une particule de masse m et de charge élémentaire q est :

Ainsi, les noyaux atomiques, beaucoup plus lourds qu'un électron, contribuent de manière négligeable aux rayons X diffusés.

Développement de 1912 à 1920

Bien que les diamants (en haut à gauche) et le graphite (en haut à droite) aient une composition chimique identique, étant tous deux du carbone pur, la cristallographie aux rayons X a révélé que la disposition de leurs atomes (en bas) explique leurs propriétés différentes. Dans le diamant, les atomes de carbone sont disposés de manière tétraédrique et maintenus ensemble par des liaisons covalentes simples , ce qui le rend fort dans toutes les directions. En revanche, le graphite est composé de feuilles empilées. À l'intérieur de la feuille, la liaison est covalente et présente une symétrie hexagonale, mais il n'y a pas de liaisons covalentes entre les feuilles, ce qui facilite le clivage du graphite en flocons.

Après les recherches pionnières de Von Laue, le domaine s'est développé rapidement, notamment par les physiciens William Lawrence Bragg et son père William Henry Bragg . En 1912-1913, le jeune Bragg a développé la loi de Bragg , qui relie la diffusion observée aux réflexions de plans régulièrement espacés dans le cristal. Les Bragg, père et fils, ont partagé le prix Nobel de physique 1915 pour leurs travaux en cristallographie. Les premières structures étaient généralement simples et marquées par une symétrie unidimensionnelle. Cependant, à mesure que les méthodes de calcul et expérimentales se sont améliorées au cours des décennies suivantes, il est devenu possible de déduire des positions atomiques fiables pour des arrangements plus complexes en deux et trois dimensions des atomes dans la cellule unitaire.

Le potentiel de la cristallographie aux rayons X pour déterminer la structure des molécules et des minéraux, alors que vaguement connue à partir d'expériences chimiques et hydrodynamiques, a été réalisé immédiatement. Les premières structures étaient de simples cristaux et minéraux inorganiques, mais même celles-ci révélaient les lois fondamentales de la physique et de la chimie. La première structure à résolution atomique à être « résolue » (c'est-à-dire déterminée) en 1914 était celle du sel de table . La distribution des électrons dans la structure du sel de table a montré que les cristaux ne sont pas nécessairement composés de molécules liées par covalence , et a prouvé l'existence de composés ioniques . La structure du diamant a été résolue la même année, prouvant l'arrangement tétraédrique de ses liaisons chimiques et montrant que la longueur de la liaison simple C-C était de 1,52 angströms. D'autres structures anciennes comprenaient le cuivre , le fluorure de calcium (CaF 2 , également connu sous le nom de fluorite ), la calcite (CaCO 3 ) et la pyrite (FeS 2 ) en 1914; spinelle (MgAl 2 O 4 ) en 1915; les formes rutile et anatase du dioxyde de titane (TiO 2 ) en 1916 ; pyrochroïte Mn(OH) 2 et, par extension, brucite Mg(OH) 2 en 1919. Toujours en 1919, le nitrate de sodium (NaNO 3 ) et le dichloroiodure de césium (CsICl 2 ) ont été déterminés par Ralph Walter Graystone Wyckoff , et la wurtzite (hexagonale La structure ZnS) est devenue connue en 1920.

La structure du graphite a été résolue en 1916 par la méthode connexe de diffraction de la poudre , qui a été développée par Peter Debye et Paul Scherrer et, indépendamment, par Albert Hull en 1917. La structure du graphite a été déterminée à partir de la diffraction monocristalline en 1924 par deux groupes indépendamment. Hull a également utilisé la méthode de la poudre pour déterminer les structures de divers métaux, tels que le fer et le magnésium.

Importance culturelle et esthétique

En 1951, le Festival Pattern Group du Festival of Britain a accueilli un groupe collaboratif de fabricants de textiles et de cristallographes expérimentés pour concevoir de la dentelle et des imprimés basés sur la cristallographie aux rayons X de l' insuline , de la kaolin et de l' hémoglobine . L'un des principaux scientifiques du projet était le Dr Helen Megaw (1907-2002), à l'époque directrice adjointe de la recherche au Cavendish Laboratory de Cambridge. Megaw est crédité comme l'une des figures centrales qui s'est inspirée des diagrammes de cristal et a vu leur potentiel dans la conception. En 2008, la Wellcome Collection à Londres a organisé une exposition sur le Festival Pattern Group intitulée "From Atom to Patterns".

Contributions à la chimie et à la science des matériaux

La cristallographie aux rayons X a permis de mieux comprendre les liaisons chimiques et les interactions non covalentes . Les premières études ont révélé les rayons typiques des atomes et ont confirmé de nombreux modèles théoriques de liaison chimique, tels que la liaison tétraédrique du carbone dans la structure du diamant, la liaison octaédrique des métaux observée dans l'hexachloroplatinate d'ammonium (IV) et la résonance observée dans le groupe carbonate planaire et dans les molécules aromatiques. La structure de l' hexaméthylbenzène de Kathleen Lonsdale en 1928 a établi la symétrie hexagonale du benzène et a montré une nette différence de longueur de liaison entre les liaisons C-C aliphatiques et les liaisons C-C aromatiques ; cette découverte a conduit à l'idée de résonance entre les liaisons chimiques, qui a eu des conséquences profondes pour le développement de la chimie. Ses conclusions ont été anticipées par William Henry Bragg , qui a publié en 1921 des modèles de naphtalène et d' anthracène basés sur d'autres molécules, une forme précoce de remplacement moléculaire .

Toujours dans les années 1920, Victor Moritz Goldschmidt et plus tard Linus Pauling ont développé des règles pour éliminer les structures chimiquement improbables et pour déterminer les tailles relatives des atomes. Ces règles ont conduit à la structure de la brookite (1928) et à une compréhension de la stabilité relative des formes rutile , brookite et anatase du dioxyde de titane .

La distance entre deux atomes liés est une mesure sensible de la force de liaison et de son ordre de liaison ; ainsi, les études cristallographiques aux rayons X ont conduit à la découverte de types de liaisons encore plus exotiques en chimie inorganique , tels que les doubles liaisons métal-métal, les quadruples liaisons métal-métal et les liaisons à trois centres et deux électrons. La cristallographie aux rayons X - ou, à proprement parler, une expérience de diffusion Compton inélastique - a également fourni des preuves du caractère partiellement covalent des liaisons hydrogène . Dans le domaine de la chimie organométallique , la structure aux rayons X du ferrocène a initié des études scientifiques sur les composés sandwich , tandis que celle du sel de Zeise a stimulé la recherche sur la « liaison arrière » et les complexes métal-pi. Enfin, la cristallographie aux rayons X a joué un rôle de pionnier dans le développement de la chimie supramoléculaire , notamment en clarifiant les structures des éthers couronnes et les principes de la chimie hôte-invité .

La diffraction des rayons X est un outil très puissant dans le développement de catalyseurs . Des mesures ex-situ sont effectuées en routine pour vérifier la structure cristalline des matériaux ou pour démêler de nouvelles structures. Les expériences in situ donnent une compréhension globale de la stabilité structurelle des catalyseurs dans des conditions de réaction.

En sciences des matériaux, de nombreux systèmes inorganiques et organométalliques complexes ont été analysés à l'aide de méthodes monocristallines, telles que les fullerènes , les métalloporphyrines et d'autres composés complexes. La diffraction monocristalline est également utilisée dans l' industrie pharmaceutique , en raison de problèmes récents avec les polymorphes . Les principaux facteurs affectant la qualité des structures monocristallines sont la taille et la régularité du cristal ; la recristallisation est une technique couramment utilisée pour améliorer ces facteurs dans les cristaux de petites molécules. La base de données structurelle de Cambridge contient plus de 1 000 000 de structures en juin 2019 ; plus de 99% de ces structures ont été déterminées par diffraction des rayons X.

Minéralogie et métallurgie

Première vue par diffraction des rayons X du sol martien - L'analyse CheMin révèle du feldspath , des pyroxènes , de l' olivine et plus encore ( rover Curiosity à " Rocknest " , 17 octobre 2012).

Depuis les années 1920, la diffraction des rayons X est la principale méthode pour déterminer l'arrangement des atomes dans les minéraux et les métaux . L'application de la cristallographie aux rayons X à la minéralogie a commencé avec la structure du grenat , qui a été déterminée en 1924 par Menzer. Une étude cristallographique systématique aux rayons X des silicates a été entreprise dans les années 1920. Cette étude a montré que, lorsque le rapport Si / O est altéré, les cristaux de silicate présentent des changements importants dans leurs arrangements atomiques. Machatschki a étendu ces connaissances aux minéraux dans lesquels l' aluminium se substitue aux atomes de silicium des silicates. La première application de la cristallographie aux rayons X à la métallurgie a également eu lieu au milieu des années 1920. Plus particulièrement, la structure de Linus Pauling de l'alliage Mg 2 Sn a conduit à sa théorie de la stabilité et de la structure des cristaux ioniques complexes.

Le 17 octobre 2012, le rover Curiosity sur la planète Mars à « Rocknest » a effectué la première analyse par diffraction des rayons X du sol martien . Les résultats de l' analyseur CheMin du rover ont révélé la présence de plusieurs minéraux, dont du feldspath , des pyroxènes et de l' olivine , et ont suggéré que le sol martien de l'échantillon était similaire aux " sols basaltiques altérés " des volcans hawaïens .

Premières molécules organiques et petites molécules biologiques

La structure tridimensionnelle de la pénicilline , résolue par Dorothy Crowfoot Hodgkin en 1945. Les sphères vertes, rouges, jaunes et bleues représentent respectivement des atomes de carbone , d' oxygène , de soufre et d' azote . Les sphères blanches représentent l' hydrogène , qui ont été déterminés mathématiquement plutôt que par l'analyse aux rayons X.

La première structure d'un composé organique, l' hexaméthylènetétramine , a été résolue en 1923. Cela a été suivi par plusieurs études sur les acides gras à longue chaîne , qui sont un composant important des membranes biologiques . Dans les années 1930, les structures de molécules beaucoup plus grosses avec une complexité bidimensionnelle ont commencé à être résolues. Une avancée significative a été la structure de la phtalocyanine , une grande molécule plane qui est étroitement liée aux molécules de porphyrine importantes en biologie, telles que l' hème , la corrine et la chlorophylle .

La cristallographie aux rayons X de molécules biologiques a décollé avec Dorothy Crowfoot Hodgkin , qui a résolu les structures du cholestérol (1937), de la pénicilline (1946) et de la vitamine B 12 (1956), pour laquelle elle a reçu le prix Nobel de chimie en 1964. Dans 1969, elle réussit à résoudre la structure de l' insuline , sur laquelle elle travailla pendant plus de trente ans.

Cristallographie macromoléculaire biologique

Diagramme en ruban de la structure de la myoglobine , montrant des hélices alpha colorées . De telles protéines sont de longues molécules linéaires avec des milliers d'atomes ; pourtant, la position relative de chaque atome a été déterminée avec une résolution subatomique par cristallographie aux rayons X. Comme il est difficile de visualiser tous les atomes à la fois, le ruban montre le chemin approximatif du squelette de la protéine de son extrémité N-terminale (bleu) à son extrémité C-terminale (rouge).

Les structures cristallines des protéines (qui sont irrégulières et des centaines de fois plus grosses que le cholestérol) ont commencé à être résolues à la fin des années 1950, à commencer par la structure de la myoglobine du cachalot par Sir John Cowdery Kendrew , pour laquelle il a partagé le prix Nobel de chimie avec Max Perutz en 1962. Depuis ce succès, plus de 130 000 structures cristallines aux rayons X de protéines, d'acides nucléiques et d'autres molécules biologiques ont été déterminées. La méthode concurrente la plus proche en nombre de structures analysées est la spectroscopie par résonance magnétique nucléaire (RMN) , qui en a résolu moins d'un dixième. La cristallographie peut résoudre des structures de molécules arbitrairement grandes, alors que la RMN à l'état de solution est limitée à des molécules relativement petites (moins de 70 k Da ). La cristallographie aux rayons X est utilisée en routine pour déterminer comment un médicament pharmaceutique interagit avec sa cible protéique et quels changements pourraient l'améliorer. Cependant, les protéines membranaires intrinsèques restent difficiles à cristalliser car elles nécessitent des détergents ou d'autres dénaturants pour les solubiliser de manière isolée, et ces détergents interfèrent souvent avec la cristallisation. Les protéines membranaires sont une composante importante du génome et comprennent de nombreuses protéines d'une grande importance physiologique, telles que les canaux ioniques et les récepteurs . La cryogénie à l'hélium est utilisée pour prévenir les dommages causés par les radiations dans les cristaux de protéines.

À l'autre extrémité de l'échelle de taille, même des molécules relativement petites peuvent poser des problèmes pour le pouvoir de résolution de la cristallographie aux rayons X. La structure attribuée en 1991 à l'antibiotique isolé d'un organisme marin, le diazonamide A (C 40 H 34 Cl 2 N 6 O 6 , masse molaire 765,65 g/mol), s'est avérée incorrecte par la preuve classique de structure : un échantillon synthétique n'était pas identique au produit naturel. L'erreur a été attribuée à l'incapacité de la cristallographie aux rayons X à faire la distinction entre les groupes -OH / -NH corrects et les groupes -NH 2 / -O- échangés dans la structure incorrecte. Avec les progrès de l'instrumentation, cependant, des groupes similaires peuvent être distingués à l'aide de diffractomètres à rayons X monocristallins modernes.

Bien qu'elle soit un outil inestimable en biologie structurelle , la cristallographie des protéines comporte certains problèmes inhérents à sa méthodologie qui entravent l'interprétation des données. Le réseau cristallin, qui se forme pendant le processus de cristallisation, contient de nombreuses unités de la protéine purifiée, qui sont densément et symétriquement emballées dans le cristal. Lorsque vous recherchez une protéine auparavant inconnue, il peut être difficile de déterminer sa forme et ses limites dans le réseau cristallin. Les protéines sont généralement composées de sous-unités plus petites, et la tâche de distinguer entre les sous-unités et d'identifier la protéine réelle peut être difficile même pour les cristallographes expérimentés. Les interfaces non biologiques qui se produisent pendant la cristallisation sont appelées contacts de cristallisation (ou simplement contacts cristallins) et ne peuvent pas être distinguées par des moyens cristallographiques. Lorsqu'une nouvelle structure protéique est résolue par cristallographie aux rayons X et déposée dans la Protein Data Bank , ses auteurs sont priés de spécifier "l'assemblage biologique" qui constituerait la protéine fonctionnelle et biologiquement pertinente. Cependant, des erreurs, des données manquantes et des annotations inexactes lors de la soumission des données, donnent lieu à des structures obscures et compromettent la fiabilité de la base de données. Le taux d'erreur dans le cas des seules annotations défectueuses a été signalé à plus de 6,6% ou environ 15%, sans doute une taille non négligeable compte tenu du nombre de structures déposées. Ce "problème de classification d'interface" est généralement abordé par des approches informatiques et est devenu un sujet reconnu en bioinformatique structurelle .

Techniques de diffusion

Diffusion élastique vs. inélastique

La cristallographie aux rayons X est une forme de diffusion élastique ; les rayons X sortants ont la même énergie, et donc la même longueur d'onde, que les rayons X entrants, uniquement avec une direction modifiée. En revanche, la diffusion inélastique se produit lorsque l'énergie est transférée du rayon X entrant au cristal, par exemple, en excitant un électron de la couche interne à un niveau d' énergie plus élevé . Une telle diffusion inélastique réduit l'énergie (ou augmente la longueur d'onde) du faisceau sortant. La diffusion inélastique est utile pour sonder de telles excitations de la matière, mais pas pour déterminer la distribution des diffuseurs au sein de la matière, ce qui est l'objectif de la cristallographie aux rayons X.

Les rayons X ont une longueur d'onde de 10 à 0,01 nanomètres ; une longueur d' onde typique utilisée pour la cristallographie est une  Å (0,1 nm), ce qui est à l'échelle de covalentes des liaisons chimiques et le rayon d'un seul atome. Les photons de plus grande longueur d'onde (comme le rayonnement ultraviolet ) n'auraient pas une résolution suffisante pour déterminer les positions atomiques. À l'autre extrême, les photons de longueur d'onde plus courte tels que les rayons gamma sont difficiles à produire en grand nombre, difficiles à focaliser et interagissent trop fortement avec la matière, produisant des paires particule-antiparticule . Par conséquent, les rayons X sont le "sweetspot" pour la longueur d'onde lors de la détermination des structures à résolution atomique à partir de la diffusion du rayonnement électromagnétique .

Autres techniques de radiographie

D'autres formes de diffusion élastique des rayons X en plus de la diffraction monocristalline comprennent la diffraction sur poudre , la diffusion des rayons X aux petits angles ( SAXS ) et plusieurs types de diffraction par fibre aux rayons X , qui a été utilisée par Rosalind Franklin pour déterminer la structure en double hélice. d' ADN . En général, la diffraction des rayons X sur monocristal offre plus d'informations structurelles que ces autres techniques ; cependant, elle nécessite un cristal suffisamment gros et régulier, ce qui n'est pas toujours disponible.

Ces méthodes de diffusion utilisent généralement des rayons X monochromatiques , qui sont limités à une seule longueur d'onde avec des écarts mineurs. Un large spectre de rayons X (c'est-à-dire un mélange de rayons X avec différentes longueurs d'onde) peut également être utilisé pour effectuer la diffraction des rayons X, une technique connue sous le nom de méthode de Laue. C'est la méthode utilisée dans la découverte originale de la diffraction des rayons X. La diffusion de Laue fournit de nombreuses informations structurelles avec seulement une courte exposition au faisceau de rayons X, et est donc utilisée dans les études structurelles d'événements très rapides ( Cristallographie résolue dans le temps ). Cependant, elle n'est pas aussi bien adaptée que la diffusion monochromatique pour déterminer la structure atomique complète d'un cristal et fonctionne donc mieux avec des cristaux avec des arrangements atomiques relativement simples.

Le mode de rétroréflexion de Laue enregistre les rayons X diffusés vers l'arrière à partir d'une source à large spectre. Ceci est utile si l'échantillon est trop épais pour que les rayons X puissent le traverser. Les plans diffractants dans le cristal sont déterminés en sachant que la normale au plan diffractant coupe l'angle entre le faisceau incident et le faisceau diffracté. Un graphique de Greninger peut être utilisé pour interpréter la photographie de Laue de réflexion arrière.

Diffraction des électrons et des neutrons

D'autres particules, telles que les électrons et les neutrons , peuvent être utilisées pour produire un diagramme de diffraction . Bien que la diffusion des électrons, des neutrons et des rayons X soit basée sur des processus physiques différents, les diagrammes de diffraction résultants sont analysés en utilisant les mêmes techniques d' imagerie par diffraction cohérente .

Comme dérivé ci-dessous, la densité électronique dans le cristal et les motifs de diffraction sont liés par une méthode mathématique simple, la transformée de Fourier , qui permet de calculer la densité relativement facilement à partir des motifs. Cependant, cela ne fonctionne que si la diffusion est faible , c'est-à-dire si les faisceaux diffusés sont beaucoup moins intenses que le faisceau entrant. Les faisceaux faiblement diffusés traversent le reste du cristal sans subir un deuxième événement de diffusion. De telles ondes rediffusées sont appelées "diffusion secondaire" et gênent l'analyse. Tout cristal suffisamment épais produira une diffusion secondaire, mais étant donné que les rayons X interagissent relativement faiblement avec les électrons, ce n'est généralement pas un problème important. En revanche, les faisceaux d'électrons peuvent produire une forte diffusion secondaire même pour des cristaux relativement minces (> 100 nm). Comme cette épaisseur correspond au diamètre de nombreux virus , une direction prometteuse est la diffraction électronique d' assemblages macromoléculaires isolés , tels que les capsides virales et les machines moléculaires , qui peut être réalisée avec un cryomicroscope électronique . De plus, la forte interaction des électrons avec la matière (environ 1000 fois plus forte que pour les rayons X) permet de déterminer la structure atomique de volumes extrêmement petits. Le domaine d'applications de la cristallographie électronique s'étend des biomolécules comme les protéines membranaires sur les films minces organiques aux structures complexes des composés intermétalliques (nanocristallins) et des zéolites.

La diffraction des neutrons est une excellente méthode pour la détermination de la structure, bien qu'il ait été difficile d'obtenir des faisceaux intenses et monochromatiques de neutrons en quantités suffisantes. Traditionnellement, les réacteurs nucléaires ont été utilisés, bien que des sources produisant des neutrons par spallation soient de plus en plus disponibles. Étant non chargés, les neutrons se diffusent beaucoup plus facilement à partir des noyaux atomiques plutôt que des électrons. Par conséquent, la diffusion des neutrons est très utile pour observer les positions des atomes légers avec peu d'électrons, en particulier l' hydrogène , qui est essentiellement invisible dans la diffraction des rayons X. La diffusion des neutrons a également la propriété remarquable que le solvant peut être rendu invisible en ajustant le rapport de l' eau normale , H 2 O, et de l'eau lourde , D 2 O.

Méthodes

Présentation de la diffraction des rayons X sur monocristal

Workflow pour résoudre la structure d'une molécule par cristallographie aux rayons X.

La méthode la plus ancienne et la plus précise de cristallographie aux rayons X est la diffraction des rayons X sur monocristal , dans laquelle un faisceau de rayons X frappe un monocristal, produisant des faisceaux diffusés. Lorsqu'ils atterrissent sur un morceau de film ou un autre détecteur, ces faisceaux forment un motif de diffraction de taches ; les forces et les angles de ces faisceaux sont enregistrés au fur et à mesure que le cristal tourne. Chaque tache est appelée réflexion , car elle correspond à la réflexion des rayons X d'un ensemble de plans régulièrement espacés dans le cristal. Pour les monocristaux de pureté et de régularité suffisantes, les données de diffraction des rayons X peuvent déterminer les longueurs et les angles moyens des liaisons chimiques à quelques millièmes d'angström et à quelques dixièmes de degré , respectivement. Les atomes d'un cristal ne sont pas statiques, mais oscillent autour de leurs positions moyennes, généralement de moins de quelques dixièmes d'angström. La cristallographie aux rayons X permet de mesurer la taille de ces oscillations.

Procédure

La technique de cristallographie aux rayons X sur monocristal comporte trois étapes de base. La première étape, et souvent la plus difficile, consiste à obtenir un cristal adéquat du matériau à l'étude. Le cristal doit être suffisamment gros (généralement supérieur à 0,1 mm dans toutes les dimensions), de composition pure et de structure régulière, sans imperfections internes importantes telles que fissures ou macles .

Dans la deuxième étape, le cristal est placé dans un faisceau intense de rayons X, généralement d'une seule longueur d'onde ( rayons X monochromatiques ), produisant le motif régulier de réflexions. Les angles et les intensités des rayons X diffractés sont mesurés, chaque composé ayant un diagramme de diffraction unique. Au fur et à mesure que le cristal tourne progressivement, les réflexions précédentes disparaissent et de nouvelles apparaissent ; l'intensité de chaque tache est enregistrée à chaque orientation du cristal. Plusieurs ensembles de données peuvent devoir être collectés, chaque ensemble couvrant un peu plus de la moitié d'une rotation complète du cristal et contenant généralement des dizaines de milliers de réflexions.

Dans la troisième étape, ces données sont combinées informatiquement avec des informations chimiques complémentaires pour produire et affiner un modèle de l'arrangement des atomes dans le cristal. Le modèle final et raffiné de l'arrangement atomique, maintenant appelé structure cristalline, est généralement stocké dans une base de données publique.

Limites

Au fur et à mesure que l'unité répétitive du cristal, sa cellule unitaire, devient plus grande et plus complexe, l'image au niveau atomique fournie par la cristallographie aux rayons X devient moins bien résolue (plus « floue ») pour un nombre donné de réflexions observées. On distingue souvent deux cas limites de cristallographie aux rayons X : la cristallographie « à petite molécule » (qui inclut les solides inorganiques continus) et la cristallographie « macromoléculaire ». La cristallographie de petites molécules implique typiquement des cristaux avec moins de 100 atomes dans leur unité asymétrique ; de telles structures cristallines sont généralement si bien résolues que les atomes peuvent être discernés comme des "taches" isolées de densité électronique. En revanche, la cristallographie macromoléculaire implique souvent des dizaines de milliers d'atomes dans la maille élémentaire. De telles structures cristallines sont généralement moins bien résolues (plus « étalées »); les atomes et les liaisons chimiques apparaissent comme des tubes de densité électronique, plutôt que comme des atomes isolés. En général, les petites molécules sont également plus faciles à cristalliser que les macromolécules ; cependant, la cristallographie aux rayons X s'est avérée possible même pour les virus et les protéines avec des centaines de milliers d'atomes, grâce à une imagerie et une technologie cristallographiques améliorées. Bien que normalement la cristallographie aux rayons X ne puisse être effectuée que si l'échantillon est sous forme cristalline, de nouvelles recherches ont été menées sur l'échantillonnage de formes non cristallines d'échantillons.

Cristallisation

Un cristal de protéine vu au microscope . Les cristaux utilisés en cristallographie aux rayons X peuvent être plus petits qu'un millimètre de diamètre.

Bien que la cristallographie puisse être utilisée pour caractériser le désordre dans un cristal impur ou irrégulier, la cristallographie nécessite généralement un cristal pur de haute régularité pour résoudre la structure d'un arrangement compliqué d'atomes. Des cristaux purs et réguliers peuvent parfois être obtenus à partir de matériaux naturels ou synthétiques, tels que des échantillons de métaux , de minéraux ou d'autres matériaux macroscopiques. La régularité de ces cristaux peut parfois être améliorée avec un recuit de cristal macromoléculaire et d'autres méthodes. Cependant, dans de nombreux cas, l'obtention d'un cristal de qualité de diffraction est le principal obstacle à la résolution de sa structure de résolution atomique.

La cristallographie des petites molécules et des macromolécules diffère dans la gamme des techniques possibles utilisées pour produire des cristaux de qualité diffractionnelle. Les petites molécules ont généralement peu de degrés de liberté conformationnelle et peuvent être cristallisées par un large éventail de méthodes, telles que le dépôt chimique en phase vapeur et la recristallisation . En revanche, les macromolécules ont généralement de nombreux degrés de liberté et leur cristallisation doit être réalisée de manière à conserver une structure stable. Par exemple, les protéines et les molécules d' ARN plus grosses ne peuvent pas être cristallisées si leur structure tertiaire a été dépliée ; par conséquent, la gamme des conditions de cristallisation est limitée aux conditions de solution dans lesquelles ces molécules restent repliées.

Trois méthodes de préparation des cristaux, A : Goutte suspendue. B : Chute assise. C : Microdialyse

Les cristaux de protéines sont presque toujours cultivés en solution. L'approche la plus courante consiste à abaisser très progressivement la solubilité de ses molécules constituantes ; si cela est fait trop rapidement, les molécules précipiteront de la solution, formant une poussière inutile ou un gel amorphe au fond du récipient. La croissance cristalline en solution est caractérisée par deux étapes : la nucléation d'un cristallite microscopique (ayant peut-être seulement 100 molécules), suivie de la croissance de ce cristallite, idéalement en un cristal de qualité diffraction. Les conditions de solution qui favorisent la première étape (nucléation) ne sont pas toujours les mêmes conditions qui favorisent la deuxième étape (croissance ultérieure). L'objectif du cristallographe est d'identifier les conditions de solution qui favorisent le développement d'un seul grand cristal, car les cristaux plus gros offrent une résolution améliorée de la molécule. Par conséquent, les conditions de solution devraient défavoriser la première étape (nucléation) mais favoriser la seconde (croissance), de sorte qu'un seul gros cristal se forme par gouttelette. Si la nucléation est trop favorisée, une pluie de petits cristallites se formera dans la gouttelette, plutôt qu'un seul gros cristal ; s'il est trop peu favorisé, aucun cristal ne se formera. D'autres approches impliquent la cristallisation des protéines sous l'huile, où des solutions aqueuses de protéines sont distribuées sous l'huile liquide et l'eau s'évapore à travers la couche d'huile. Différentes huiles ont des perméabilités d'évaporation différentes, ce qui entraîne des changements de taux de concentration à partir de différents mélanges de percipients/protéines.

Il est extrêmement difficile de prédire de bonnes conditions pour la nucléation ou la croissance de cristaux bien ordonnés. En pratique, les conditions favorables sont identifiées par dépistage ; un très grand lot de molécules est préparé, et une grande variété de solutions de cristallisation sont testées. Des centaines, voire des milliers, de conditions de solution sont généralement essayées avant de trouver celle qui a réussi. Les différentes conditions peuvent utiliser un ou plusieurs mécanismes physiques pour abaisser la solubilité de la molécule ; par exemple, certains peuvent modifier le pH, certains contiennent des sels de la série Hofmeister ou des produits chimiques qui abaissent la constante diélectrique de la solution, et d'autres encore contiennent de gros polymères tels que le polyéthylène glycol qui chassent la molécule de la solution par effets entropiques. Il est également courant d'essayer plusieurs températures pour favoriser la cristallisation, ou d'abaisser progressivement la température pour que la solution devienne sursaturée. Ces méthodes nécessitent de grandes quantités de la molécule cible, car elles utilisent une concentration élevée de la ou des molécules à cristalliser. En raison de la difficulté d'obtenir de telles quantités ( milligrammes ) de protéines de qualité cristallisation, des robots ont été développés qui sont capables de distribuer avec précision des gouttes d'essai de cristallisation d'un volume de l'ordre de 100 nanolitres . Cela signifie que 10 fois moins de protéines sont utilisées par expérience par rapport aux essais de cristallisation mis en place à la main (de l'ordre de 1 microlitre ).

Plusieurs facteurs sont connus pour inhiber ou perturber la cristallisation. Les cristaux en croissance sont généralement maintenus à température constante et protégés des chocs ou vibrations qui pourraient perturber leur cristallisation. Les impuretés dans les molécules ou dans les solutions de cristallisation sont souvent hostiles à la cristallisation. La flexibilité conformationnelle de la molécule a également tendance à rendre la cristallisation moins probable, en raison de l'entropie. Les molécules qui ont tendance à s'auto-assembler en hélices régulières sont souvent réticentes à s'assembler en cristaux. Les cristaux peuvent être gâchés par le jumelage , ce qui peut se produire lorsqu'une cellule unitaire peut s'entasser de manière tout aussi favorable dans plusieurs orientations ; bien que des progrès récents dans les méthodes de calcul puissent permettre de résoudre la structure de certains cristaux jumelés. N'ayant pas réussi à cristalliser une molécule cible, un cristallographe peut réessayer avec une version légèrement modifiée de la molécule ; même de petits changements dans les propriétés moléculaires peuvent entraîner de grandes différences dans le comportement de cristallisation.

Collecte de données

Montage du cristal

Animation montrant les cinq mouvements possibles avec un goniomètre kappa à quatre cercles. Les rotations autour de chacun des quatre angles φ, κ, et 2θ laissent le cristal dans le faisceau de rayons X, mais modifient l'orientation du cristal. Le détecteur (boîte rouge) peut être glissé plus près ou plus loin du cristal, ce qui permet de prendre des données à plus haute résolution (si plus proche) ou de mieux discerner les pics de Bragg (si plus loin).

Le cristal est monté pour les mesures afin qu'il puisse être maintenu dans le faisceau de rayons X et tourné. Il existe plusieurs méthodes de montage. Dans le passé, les cristaux étaient chargés dans des capillaires en verre avec la solution de cristallisation (la liqueur mère ). De nos jours, les cristaux de petites molécules sont généralement attachés avec de l'huile ou de la colle à une fibre de verre ou à une boucle, qui est en nylon ou en plastique et attachée à une tige solide. Les cristaux de protéines sont ramassés par une boucle, puis congelés rapidement avec de l'azote liquide . Ce gel réduit les dommages causés par le rayonnement des rayons X, ainsi que le bruit dans les pics de Bragg dû au mouvement thermique (l'effet Debye-Waller). Cependant, les cristaux de protéines non traités se fissurent souvent s'ils sont congelés instantanément; par conséquent, ils sont généralement pré-trempés dans une solution cryoprotectrice avant congélation. Malheureusement, ce pré-trempage peut lui-même provoquer la fissuration du cristal, le ruinant pour la cristallographie. Généralement, les cryo-conditions réussies sont identifiées par essais et erreurs.

Le capillaire ou la boucle est monté sur un goniomètre , ce qui lui permet d'être positionné avec précision dans le faisceau de rayons X et tourné. Étant donné que le cristal et le faisceau sont souvent très petits, le cristal doit être centré dans le faisceau avec une précision d'environ 25 micromètres, ce qui est aidé par une caméra focalisée sur le cristal. Le type de goniomètre le plus courant est le « goniomètre kappa », qui offre trois angles de rotation : l'angle , qui tourne autour d'un axe perpendiculaire au faisceau ; l'angle , autour d'un axe à ~50° de l'axe  ; et, enfin, l'angle autour de l'axe boucle/capillaire. Lorsque l'angle est nul, les axes ω et sont alignés. La rotation permet un montage pratique du cristal, puisque le bras dans lequel le cristal est monté peut être basculé vers le cristallographe. Les oscillations effectuées lors de la collecte des données (mentionnées ci-dessous) concernent uniquement l'axe ω. Un type plus ancien de goniomètre est le goniomètre à quatre cercles et ses parents tels que le goniomètre à six cercles.

Sources de rayons X

Anode tournante

La cristallographie à petite échelle peut être effectuée avec une source de tube à rayons X locale , généralement couplée à un détecteur à plaque d'image . Ceux-ci ont l'avantage d'être relativement peu coûteux et faciles à entretenir, et permettent un dépistage et un prélèvement rapides d'échantillons. Cependant, la longueur d'onde de la lumière produite est limitée par la disponibilité de différents matériaux d' anode . De plus, l'intensité est limitée par la puissance appliquée et la capacité de refroidissement disponible pour éviter la fonte de l'anode. Dans de tels systèmes, les électrons sont éliminés par ébullition d'une cathode et accélérés à travers un fort potentiel électrique d'environ 50  kV ; ayant atteint une vitesse élevée, les électrons entrent en collision avec une plaque métallique, émettant du bremsstrahlung et de fortes raies spectrales correspondant à l'excitation des électrons de la couche interne du métal. Le métal le plus couramment utilisé est le cuivre , qui peut être facilement conservé au frais, en raison de sa forte conductivité thermique , et qui produit une forte K α et K de lignes. Le K de la ligne est parfois supprimée avec une feuille de nickel mince (~ 10 um). La variété la plus simple et la moins chère de tube à rayons X scellé a une anode fixe (le tube de Crookes ) et fonctionne avec une puissance de faisceau d'électrons d' environ 2  kW . La variété la plus chère a une source de type anode rotative qui fonctionne avec ~ 14 kW de puissance de faisceau électronique.

Les rayons X sont généralement filtrés (à l'aide de filtres à rayons X ) à une seule longueur d'onde (rendue monochromatique) et collimatés dans une seule direction avant de pouvoir frapper le cristal. Le filtrage simplifie non seulement l'analyse des données, mais supprime également le rayonnement qui dégrade le cristal sans apporter d'informations utiles. La collimation se fait soit avec un collimateur (en gros, un long tube) soit avec un savant agencement de miroirs légèrement incurvés. Les systèmes de miroirs sont préférés pour les petits cristaux (moins de 0,3 mm) ou avec de grandes cellules unitaires (plus de 150 Å).

Les anodes rotatives ont été utilisées par Joanna (Joka) Maria Vandenberg dans les premières expériences qui ont démontré la puissance des rayons X pour le criblage rapide (en temps réel) de grandes plaquettes à couche mince d' InGaAsP pour le contrôle qualité des lasers à puits quantiques .

Tube microfocus

Un développement plus récent est le tube microfocus , qui peut fournir un flux de faisceau au moins aussi élevé (après collimation) que les sources à anode tournante mais ne nécessite qu'une puissance de faisceau de quelques dizaines ou centaines de watts plutôt que de nécessiter plusieurs kilowatts.

Rayonnement synchrotron

Les sources de rayonnement synchrotron sont parmi les sources de lumière les plus brillantes sur terre et sont parmi les outils les plus puissants disponibles pour les cristallographes aux rayons X. Faisceaux de rayons X générés dans de grandes machines appelées synchrotrons qui accélèrent des particules chargées électriquement, souvent des électrons, à presque la vitesse de la lumière et les confinent dans une boucle (approximativement) circulaire en utilisant des champs magnétiques.

Les synchrotrons sont généralement des installations nationales, chacune avec plusieurs lignes de lumière dédiées où les données sont collectées sans interruption. Les synchrotrons ont été conçus à l'origine pour être utilisés par des physiciens des hautes énergies étudiant les particules subatomiques et les phénomènes cosmiques . Le plus gros composant de chaque synchrotron est son anneau de stockage d'électrons. Cet anneau n'est en fait pas un cercle parfait, mais un polygone à plusieurs côtés. À chaque coin du polygone, ou secteur, des aimants alignés avec précision courbent le flux d'électrons. Lorsque le chemin des électrons est courbé, ils émettent des rafales d'énergie sous forme de rayons X.

L'utilisation du rayonnement synchrotron a souvent des exigences spécifiques pour la cristallographie aux rayons X. Le rayonnement ionisant intense peut endommager les échantillons, en particulier les cristaux macromoléculaires. La cryocristallographie protège l'échantillon des dommages causés par les radiations, en congelant le cristal à des températures d' azote liquide (~ 100 K ). Cependant, le rayonnement synchrotron présente fréquemment l'avantage de longueurs d'onde sélectionnables par l'utilisateur, permettant des expériences de diffusion anormale qui maximisent le signal anormal. Ceci est essentiel dans des expériences telles que la dispersion anormale à longueur d'onde unique (SAD) et la dispersion anormale à plusieurs longueurs d'onde (MAD).

Laser à électrons libres

Des lasers à électrons libres ont été développés pour une utilisation en cristallographie aux rayons X. Ce sont les sources de rayons X les plus brillantes actuellement disponibles ; avec les rayons X arrivant en rafales femtosecondes . L'intensité de la source est telle que les diagrammes de diffraction à résolution atomique peuvent être résolus pour des cristaux autrement trop petits pour être collectés. Cependant, la source de lumière intense détruit également l'échantillon, nécessitant l'injection de plusieurs cristaux. Comme chaque cristal est orienté de manière aléatoire dans le faisceau, des centaines de milliers d'images de diffraction individuelles doivent être collectées afin d'obtenir un ensemble de données complet. Cette méthode, la cristallographie femtoseconde en série , a été utilisée pour résoudre la structure d'un certain nombre de structures cristallines de protéines, en notant parfois des différences avec des structures équivalentes collectées à partir de sources synchrotron.

Enregistrer les reflets

Diagramme de diffraction des rayons X d'une enzyme cristallisée. Le motif des taches ( réflexions ) et la force relative de chaque tache ( intensités ) peuvent être utilisés pour déterminer la structure de l'enzyme.

Lorsqu'un cristal est monté et exposé à un faisceau intense de rayons X, il diffuse les rayons X en un motif de taches ou de reflets qui peuvent être observés sur un écran derrière le cristal. Un modèle similaire peut être observé en braquant un pointeur laser sur un disque compact . Les intensités relatives de ces taches fournissent les informations pour déterminer l'arrangement des molécules dans le cristal dans les détails atomiques. Les intensités de ces réflexions peuvent être enregistrées avec un film photographique , un détecteur de zone (tel qu'un détecteur de pixels ) ou avec un capteur d'image à dispositif à couplage de charge (CCD). Les pics aux petits angles correspondent aux données à faible résolution, tandis que ceux aux angles élevés représentent les données à haute résolution ; ainsi, une limite supérieure sur la résolution éventuelle de la structure peut être déterminée à partir des premières images. Certaines mesures de la qualité de la diffraction peuvent être déterminées à ce stade, telles que la mosaïcité du cristal et son désordre global, comme observé dans les largeurs de pic. Certaines pathologies du cristal qui le rendraient impropre à la résolution de la structure peuvent également être diagnostiquées rapidement à ce stade.

Une image de taches est insuffisante pour reconstruire l'ensemble du cristal ; il ne représente qu'une petite tranche de la transformée de Fourier complète. Pour collecter toutes les informations nécessaires, le cristal doit être tourné pas à pas de 180°, avec une image enregistrée à chaque pas ; en fait, il faut un peu plus de 180° pour couvrir l'espace réciproque , en raison de la courbure de la sphère d'Ewald . Cependant, si le cristal a une symétrie plus élevée, une plage angulaire plus petite telle que 90° ou 45° peut être enregistrée. L'axe de rotation doit être modifié au moins une fois, pour éviter de développer un "angle mort" dans l'espace réciproque proche de l'axe de rotation. Il est d'usage de faire basculer légèrement le cristal (de 0,5 à 2°) pour attraper une région plus large de l'espace réciproque.

Plusieurs ensembles de données peuvent être nécessaires pour certaines méthodes de phasage . Par exemple, la mise en phase de dispersion anormale à plusieurs longueurs d'onde nécessite que la diffusion soit enregistrée au moins trois (et généralement quatre, pour la redondance) longueurs d'onde du rayonnement X entrant. Un monocristal peut se dégrader trop pendant la collecte d'un ensemble de données, en raison des dommages causés par les radiations ; dans de tels cas, des ensembles de données sur plusieurs cristaux doivent être pris.

L'analyse des données

Symétrie cristalline, cellule unitaire et mise à l'échelle de l'image

La série enregistrée de motifs de diffraction bidimensionnels, correspondant chacun à une orientation cristalline différente, est convertie en un modèle tridimensionnel de la densité électronique ; la conversion utilise la technique mathématique des transformées de Fourier, qui est expliquée ci-dessous . Chaque spot correspond à un type différent de variation de la densité électronique ; le cristallographe doit déterminer quelle variation correspond à quel spot ( indexation ), les forces relatives des spots dans différentes images ( fusion et mise à l'échelle ) et comment les variations doivent être combinées pour donner la densité électronique totale ( phasage ).

Le traitement des données commence par l' indexation des réflexions. Il s'agit d'identifier les dimensions de la maille élémentaire et quel pic d'image correspond à quelle position dans l'espace réciproque. Un sous-produit de l'indexation consiste à déterminer la symétrie du cristal, c'est-à-dire son groupe d'espace . Certains groupes d'espaces peuvent être éliminés dès le début. Par exemple, les symétries de réflexion ne peuvent pas être observées dans les molécules chirales ; ainsi, seuls 65 groupes spatiaux sur 230 possibles sont autorisés pour les molécules protéiques qui sont presque toujours chirales. L'indexation est généralement effectuée à l'aide d'une routine d' indexation automatique . Ayant affecté la symétrie, les données sont ensuite intégrées . Cela convertit les centaines d'images contenant les milliers de réflexions en un seul fichier, composé (à tout le moins) d'enregistrements de l' indice de Miller de chaque réflexion, et d'une intensité pour chaque réflexion (à cet état, le fichier comprend souvent également des estimations d'erreur et mesures de partialité (quelle partie d'une réflexion donnée a été enregistrée sur cette image)).

Un ensemble complet de données peut consister en des centaines d'images séparées prises à différentes orientations du cristal. La première étape consiste à fusionner et à mettre à l'échelle ces différentes images, c'est-à-dire à identifier les pics qui apparaissent dans deux images ou plus ( fusion ) et à mettre à l'échelle les images relatives afin qu'elles aient une échelle d'intensité cohérente. L'optimisation de l'échelle d'intensité est critique car l'intensité relative des pics est l'information clé à partir de laquelle la structure est déterminée. La technique répétitive de collecte de données cristallographiques et la symétrie souvent élevée des matériaux cristallins amènent le diffractomètre à enregistrer plusieurs fois de nombreuses réflexions équivalentes à la symétrie. Cela permet de calculer le facteur R lié à la symétrie , un indice de fiabilité basé sur la similitude des intensités mesurées des réflexions équivalentes à la symétrie, évaluant ainsi la qualité des données.

Phase initiale

Les données recueillies à partir d'une expérience de diffraction sont une représentation spatiale réciproque du réseau cristallin. La position de chaque « point » de diffraction est régie par la taille et la forme de la maille élémentaire et la symétrie inhérente au cristal. L'intensité de chaque « tache » de diffraction est enregistrée, et cette intensité est proportionnelle au carré de l' amplitude du facteur de structure . Le facteur de structure est un nombre complexe contenant des informations relatives à la fois à l' amplitude et à la phase d'une onde . Afin d'obtenir une carte de densité électronique interprétable , l'amplitude et la phase doivent être connues (une carte de densité électronique permet à un cristallographe de construire un modèle de départ de la molécule). La phase ne peut pas être enregistrée directement lors d'une expérience de diffraction : c'est ce qu'on appelle le problème de phase . Les estimations de la phase initiale peuvent être obtenues de diverses manières :

  • Méthodes de phasage ab initio ou directes  - C'est généralement la méthode de choix pour les petites molécules (<1000 atomes non hydrogène), et a été utilisée avec succès pour résoudre les problèmes de phase pour les petites protéines. Si la résolution des données est meilleure que 1,4 (140 pm),des méthodes directespeuvent être utilisées pour obtenir des informations de phase, en exploitant les relations de phase connues entre certains groupes de réflexions.
  • Remplacement moléculaire  - si une structure apparentée est connue, elle peut être utilisée comme modèle de recherche dans le remplacement moléculaire pour déterminer l'orientation et la position des molécules dans la cellule unitaire. Les phases ainsi obtenues peuvent être utilisées pour générer des cartes de densité électronique.
  • Diffusion anormale des rayons X ( phasage MAD ou SAD ) - la longueur d'onde des rayons X peut être balayée au-delà d'un bord d'absorption d'un atome, ce qui modifie la diffusion d'une manière connue. En enregistrant des ensembles complets de réflexions à trois longueurs d'onde différentes (bien au-dessous, bien au-dessus et au milieu du bord d'absorption), on peut résoudre la sous-structure des atomes diffractant anormalement et donc la structure de la molécule entière. La méthode la plus populaire pour incorporer des atomes de diffusion anormale dans des protéines consiste à exprimer la protéine dans unauxotrophe de méthionine (un hôte incapable de synthétiser la méthionine) dans un milieu riche en séléno-méthionine, qui contient desatomes de sélénium . Une expérience de dispersion anormale à plusieurs longueurs d'onde (MAD) peut ensuite être menée autour du bord d'absorption, ce qui devrait ensuite donner la position de tous les résidus de méthionine dans la protéine, fournissant les phases initiales.
  • Méthodes des atomes lourds ( remplacement isomorphe multiple ) - Si des atomes métalliques denses aux électrons peuvent être introduits dans le cristal, des méthodes directes ou des méthodes de l'espace de Patterson peuvent être utilisées pour déterminer leur emplacement et obtenir les phases initiales. De tels atomes lourds peuvent être introduits soit par trempage du cristal dans une solution contenant des atomes lourds, soit par co-cristallisation (croissance des cristaux en présence d'un atome lourd). Comme dans la mise en phase de dispersion anormale à plusieurs longueurs d'onde, les changements dans les amplitudes de diffusion peuvent être interprétés pour donner les phases. Bien qu'il s'agisse de la méthode originale par laquelle les structures cristallines des protéines ont été résolues, elle a été largement remplacée par la mise en phase de dispersion anormale à plusieurs longueurs d'onde avec la sélénométhionine.

Construction du modèle et raffinement des phases

Structure d'une hélice alpha de protéine, avec des figures de bâton pour la liaison covalente au sein de la densité électronique pour la structure cristalline à ultra-haute résolution (0,91 Å). Les contours de densité sont en gris, le squelette de l'hélice en blanc, les chaînes latérales en cyan, les atomes O en rouge, les atomes N en bleu et les liaisons hydrogène en pointillés verts.
Représentation 3D de la densité électronique (bleu) d'un ligand (orange) lié à un site de liaison dans une protéine (jaune). La densité électronique est obtenue à partir de données expérimentales, et le ligand est modélisé dans cette densité électronique.

Après avoir obtenu des phases initiales, un modèle initial peut être construit. Les positions atomiques dans le modèle et leurs facteurs Debye-Waller respectifs (ou facteurs B , représentant le mouvement thermique de l'atome) peuvent être affinés pour s'adapter aux données de diffraction observées, produisant idéalement un meilleur ensemble de phases. Un nouveau modèle peut alors être ajusté à la nouvelle carte de densité électronique et des cycles successifs de raffinement sont effectués. Ce processus interactif se poursuit jusqu'à ce que la corrélation entre les données de diffraction et le modèle soit maximisée. L'accord est mesuré par un facteur R défini comme

F est le facteur de structure . Un critère de qualité similaire est R free , qui est calculé à partir d'un sous-ensemble (~10 %) de réflexions qui n'ont pas été incluses dans le raffinement de la structure. Les deux facteurs R dépendent de la résolution des données. En règle générale, R libre devrait être approximativement la résolution en angströms divisée par 10 ; ainsi, un ensemble de données avec une résolution de 2 devrait donner un R libre final ~ 0,2. Les caractéristiques de liaison chimique telles que la stéréochimie, la liaison hydrogène et la distribution des longueurs et des angles de liaison sont des mesures complémentaires de la qualité du modèle. Le biais de phase est un problème sérieux dans une telle construction de modèle itératif. Omettre les cartes est une technique courante utilisée pour vérifier cela.

Il peut ne pas être possible d'observer chaque atome dans l'unité asymétrique. Dans de nombreux cas, le désordre cristallographique brouille la carte de densité électronique. Les atomes à faible diffusion tels que l'hydrogène sont systématiquement invisibles. Il est également possible qu'un seul atome apparaisse plusieurs fois sur une carte de densité électronique, par exemple, si une chaîne latérale de protéine a plusieurs (<4) conformations autorisées. Dans d'autres cas encore, le cristallographe peut détecter que la structure covalente déduite pour la molécule était incorrecte ou modifiée. Par exemple, les protéines peuvent être clivées ou subir des modifications post-traductionnelles qui n'ont pas été détectées avant la cristallisation.

Désordre

Un défi commun dans le raffinement des structures cristallines résulte du désordre cristallographique. Le trouble peut prendre de nombreuses formes mais implique en général la coexistence de deux ou plusieurs espèces ou conformations. Le fait de ne pas reconnaître le trouble entraîne une interprétation erronée. Les pièges d'une modélisation incorrecte du désordre sont illustrés par l'hypothèse actualisée de l' isomérie d'étirement des liaisons . Le trouble est modélisé par rapport à la population relative des composants, souvent seulement deux, et à leur identité. Dans les structures de grosses molécules et d'ions, le solvant et les contre-ions sont souvent désordonnés.

Analyse de données informatiques appliquées

L'utilisation de méthodes informatiques pour l'analyse des données de diffraction des rayons X sur poudre est maintenant généralisée. Il compare généralement les données expérimentales au diffractogramme simulé d'une structure de modèle, en tenant compte des paramètres instrumentaux, et affine les paramètres structurels ou microstructuraux du modèle à l'aide d'un algorithme de minimisation basé sur les moindres carrés . La plupart des outils disponibles permettant l'identification des phases et le raffinement structurel sont basés sur la méthode Rietveld , certains d'entre eux étant des logiciels libres et ouverts tels que FullProf Suite, Jana2006, MAUD, Rietan, GSAS, etc. tandis que d'autres sont disponibles sous des licences commerciales telles que Diffrac. Suite TOPAS, Match!, etc. La plupart de ces outils permettent également un raffinement de Le Bail (appelé aussi correspondance de profil), c'est-à-dire un raffinement des paramètres de la cellule en fonction des positions des pics de Bragg et des profils de pics, sans tenir compte de la structurer par lui-même. Des outils plus récents permettent d'affiner à la fois les données structurelles et microstructurales, comme le programme FAULTS inclus dans la suite FullProf, qui permet le raffinement de structures avec des défauts planaires (par exemple des défauts d'empilement, des jumelages, des intercroissances).

Dépôt de la structure

Une fois le modèle de structure d'une molécule finalisé, il est souvent déposé dans une base de données cristallographique comme la Cambridge Structural Database (pour les petites molécules), l' Inorganic Crystal Structure Database (ICSD) (pour les composés inorganiques) ou la Protein Data Bank ( pour les protéines et parfois les acides nucléiques). De nombreuses structures obtenues dans des entreprises commerciales privées pour cristalliser des protéines pertinentes en médecine ne sont pas déposées dans des bases de données cristallographiques publiques.

Théorie de la diffraction

L'objectif principal de la cristallographie aux rayons X est de déterminer la densité d'électrons f ( r ) dans tout le cristal, où r représente le vecteur de position tridimensionnel dans le cristal. Pour ce faire, la diffusion des rayons X est utilisée pour collecter des données sur sa transformée de Fourier F ( q ), qui est inversée mathématiquement pour obtenir la densité définie dans l'espace réel, en utilisant la formule

où l' intégrale est prise sur toutes les valeurs de q . Le vecteur réel tridimensionnel q représente un point dans l'espace réciproque , c'est-à-dire une oscillation particulière de la densité électronique lorsque l'on se déplace dans la direction vers laquelle pointe q . La longueur de q correspond à divisé par la longueur d'onde de l'oscillation. La formule correspondante pour une transformée de Fourier sera utilisée ci-dessous

où l' intégrale est sommée sur toutes les valeurs possibles du vecteur de position r dans le cristal.

La transformée de Fourier F ( q ) est généralement un nombre complexe , et a donc une amplitude | F ( q )| et une phase de φ ( q ) en relation par l'équation

Les intensités des réflexions observées en diffraction des rayons X nous donnent les magnitudes | F ( q )| mais pas les phases & phiv ( q ). Pour obtenir les phases, des ensembles complets de réflexions sont collectés avec des altérations connues de la diffusion, soit en modulant la longueur d'onde au-delà d'un certain bord d'absorption, soit en ajoutant des atomes métalliques fortement diffusants (c'est-à-dire denses en électrons) tels que le mercure . La combinaison des amplitudes et des phases donne la transformée de Fourier complète F ( q ), qui peut être inversée pour obtenir la densité électronique f ( r ).

Les cristaux sont souvent idéalisés comme étant parfaitement périodiques. Dans ce cas idéal, les atomes sont positionnés sur un réseau parfait, la densité électronique est parfaitement périodique et la transformée de Fourier F ( q ) est nulle sauf lorsque q appartient au réseau réciproque (les pics dits de Bragg ). En réalité, cependant, les cristaux ne sont pas parfaitement périodiques ; les atomes vibrent autour de leur position moyenne, et il peut y avoir des désordres de divers types, tels que la mosaïcité , les dislocations , divers défauts ponctuels et l'hétérogénéité dans la conformation des molécules cristallisées. Par conséquent, les pics de Bragg ont une largeur finie et il peut y avoir une diffusion diffuse importante , un continuum de rayons X diffusés qui tombent entre les pics de Bragg.

Compréhension intuitive par la loi de Bragg

Une compréhension intuitive de la diffraction des rayons X peut être obtenue à partir du modèle de diffraction de Bragg . Dans ce modèle, une réflexion donnée est associée à un ensemble de feuilles régulièrement espacées traversant le cristal, passant généralement par les centres des atomes du réseau cristallin. L'orientation d'un ensemble particulier de feuilles est identifiée par ses trois indices de Miller ( h , k , l ), et notons leur espacement par d . William Lawrence Bragg a proposé un modèle dans lequel les rayons X entrants sont diffusés de manière spéculaire (comme un miroir) à partir de chaque plan ; à partir de cette hypothèse, les rayons X diffusés à partir de plans adjacents se combineront de manière constructive ( interférence constructive ) lorsque l'angle entre le plan et les rayons X entraîne une différence de longueur de trajet qui est un multiple entier n de la longueur d'onde des rayons X λ .

Une réflexion est dite indexée lorsque ses indices de Miller (ou, plus correctement, ses composantes vectorielles de réseau réciproques ) ont été identifiés à partir de la longueur d'onde connue et de l'angle de diffusion 2θ. Une telle indexation donne les paramètres de la maille élémentaire , les longueurs et les angles de la maille élémentaire, ainsi que son groupe d'espaces . Puisque la loi de Bragg n'interprète pas les intensités relatives des réflexions, cependant, elle est généralement inadéquate pour résoudre l'arrangement des atomes dans la cellule unitaire ; pour cela, une méthode de transformée de Fourier doit être effectuée.

La diffusion sous forme de transformée de Fourier

Le faisceau de rayons X entrant a une polarisation et doit être représenté comme une onde vectorielle ; cependant, pour plus de simplicité, qu'elle soit représentée ici comme une onde scalaire. Nous ignorons également la complication de la dépendance temporelle de l'onde et nous nous concentrons uniquement sur la dépendance spatiale de l'onde. Les ondes planes peuvent être représentées par un vecteur d'onde k in , et donc la force de l'onde entrante au temps t  = 0 est donnée par

A la position r dans l'échantillon, soit une densité de diffuseurs f ( r ) ; ces diffuseurs devraient produire une onde sphérique diffusée d'amplitude proportionnelle à l'amplitude locale de l'onde incidente multipliée par le nombre de diffuseurs dans un petit volume dV environ r

S est la constante de proportionnalité.

Considérons la fraction d'ondes diffusées qui partent avec un vecteur d'onde sortant de k out et frappent l'écran à r screen . Étant donné qu'aucune énergie n'est perdue (diffusion élastique et non inélastique), les longueurs d'onde sont les mêmes que les amplitudes des vecteurs d'onde | k dans |=| k out |. A partir du moment où le photon est diffusé à r jusqu'à ce qu'il soit absorbé à r écran , le photon subit un changement de phase

Le rayonnement net arrivant à l' écran r est la somme de toutes les ondes diffusées dans le cristal

qui peut s'écrire sous la forme d'une transformée de Fourier

q = k out  – k in . L'intensité mesurée de la réflexion sera au carré de cette amplitude

Les copains de Friedel et Bijvoet

Pour chaque réflexion correspondant à un point q dans l'espace réciproque, il y a une autre réflexion de même intensité au point opposé - q . Cette réflexion opposée est connue sous le nom de compagnon de Friedel de la réflexion originale. Cette symétrie résulte du fait mathématique que la densité d'électrons f ( r ) à une position r est toujours un nombre réel . Comme noté ci-dessus, f ( r ) est la transformée inverse de sa transformée de Fourier F ( q ); cependant, une telle transformation inverse est un nombre complexe en général. Pour s'assurer que f ( r ) est réel, la transformée de Fourier F ( q ) doit être telle que les compagnons de Friedel F (− q ) et F ( q ) soient des conjugués complexes l'un de l'autre. Ainsi, F (− q ) a la même amplitude que F ( q ) mais ils ont la phase opposée, c'est-à-dire φ ( q ) = − φ ( q )

L'égalité de leurs grandeurs garantit que les compagnons de Friedel ont la même intensité | F | 2 . Cette symétrie permet de mesurer la transformée de Fourier complète à partir de seulement la moitié de l'espace réciproque, par exemple en faisant tourner le cristal d'un peu plus de 180° au lieu d'une révolution complète de 360°. Dans les cristaux avec une symétrie significative, encore plus de réflexions peuvent avoir la même intensité (Bijvoet mate) ; dans de tels cas, il faudra peut-être mesurer encore moins de l'espace réciproque. Dans les cas favorables de symétrie élevée, parfois seulement 90° voire seulement 45° de données sont nécessaires pour explorer complètement l'espace réciproque.

La contrainte de Friedel-mate peut être dérivée de la définition de la transformée de Fourier inverse

Puisque la formule d'Euler stipule que e i x = cos( x ) + i sin( x ), la transformée de Fourier inverse peut être séparée en une somme d'une partie purement réelle et d'une partie purement imaginaire

La fonction f ( r ) est réelle si et seulement si la seconde intégrale I sin est nulle pour toutes les valeurs de r . À son tour, cela est vrai si et seulement si la contrainte ci-dessus est satisfaite

puisque je pèche = − je pèche implique que je pèche  = 0.

La sphère d'Ewald

Chaque image de diffraction des rayons X ne représente qu'une tranche, une tranche sphérique de l'espace réciproque, comme on peut le voir par la construction de la sphère d'Ewald. Les deux k sur et k en ont la même longueur, en raison de la diffusion élastique, étant donné que la longueur d' onde n'a pas changé. Par conséquent, ils peuvent être représentés comme deux vecteurs radiaux dans une sphère dans l'espace réciproque , qui montre les valeurs de q qui sont échantillonnées dans une image de diffraction donnée. Comme il y a un léger étalement dans les longueurs d'onde entrantes du faisceau de rayons X entrant, les valeurs de | F ( q )| ne peut être mesuré que pour q vecteurs situés entre les deux sphères correspondant à ces rayons. Par conséquent, pour obtenir un ensemble complet de données de transformée de Fourier, il est nécessaire de faire tourner le cristal d'un peu plus de 180°, ou parfois moins si une symétrie suffisante est présente. Une rotation complète de 360° n'est pas nécessaire en raison d'une symétrie intrinsèque aux transformées de Fourier des fonctions réelles (telles que la densité électronique), mais "un peu plus" que 180° est nécessaire pour couvrir tout l'espace réciproque dans une résolution donnée en raison de la courbure de la sphère d'Ewald . En pratique, le cristal est basculé d'une petite quantité (0,25 à 1°) pour incorporer des réflexions près des limites des coquilles sphériques d'Ewald.

Fonction Patterson

Un résultat bien connu des transformées de Fourier est le théorème d' autocorrélation , qui stipule que l'autocorrélation c ( r ) d'une fonction f ( r )

a une transformée de Fourier C ( q ) qui est la grandeur au carré de F ( q )

Par conséquent, la fonction d'autocorrélation c ( r ) de la densité électronique (également appelée fonction de Patterson ) peut être calculée directement à partir des intensités de réflexion, sans calculer les phases. En principe, cela pourrait être utilisé pour déterminer directement la structure cristalline ; cependant, il est difficile à réaliser dans la pratique. La fonction d'autocorrélation correspond à la répartition des vecteurs entre atomes dans le cristal ; ainsi, un cristal de N atomes dans sa maille élémentaire peut avoir N ( N  − 1) pics dans sa fonction de Patterson. Compte tenu des inévitables erreurs de mesure des intensités, et des difficultés mathématiques de reconstruction des positions atomiques à partir des vecteurs interatomiques, cette technique est rarement utilisée pour résoudre des structures, sauf pour les cristaux les plus simples.

Avantages d'un cristal

En principe, une structure atomique pourrait être déterminée en appliquant la diffusion des rayons X à des échantillons non cristallins, même à une seule molécule. Cependant, les cristaux offrent un signal beaucoup plus fort en raison de leur périodicité. Un échantillon cristallin est par définition périodique ; un cristal est composé de plusieurs cellules unitaires répétées indéfiniment dans trois directions indépendantes. De tels systèmes périodiques ont une transformée de Fourier qui est concentrée en des points se répétant périodiquement dans l'espace réciproque connus sous le nom de pics de Bragg ; les pics de Bragg correspondent aux taches de réflexion observées sur l'image de diffraction. Comme l'amplitude à ces réflexions croît linéairement avec le nombre N de diffuseurs, l' intensité observée de ces taches devrait croître quadratiquement, comme N 2 . En d'autres termes, l'utilisation d'un cristal concentre la faible diffusion des cellules unitaires individuelles en une réflexion beaucoup plus puissante et cohérente qui peut être observée au-dessus du bruit. C'est un exemple d' interférence constructive .

Dans un échantillon liquide, en poudre ou amorphe, les molécules de cet échantillon sont dans des orientations aléatoires. De tels échantillons ont un spectre de Fourier continu qui étale uniformément son amplitude, réduisant ainsi l'intensité du signal mesuré, comme cela est observé dans SAXS . Plus important encore, les informations d'orientation sont perdues. Bien que théoriquement possible, il est expérimentalement difficile d'obtenir des structures à résolution atomique de molécules asymétriques compliquées à partir de telles données moyennées en rotation. Un cas intermédiaire est la diffraction sur fibre dans laquelle les sous-unités sont disposées périodiquement dans au moins une dimension.

Prix ​​Nobel impliquant la cristallographie aux rayons X

Année Lauréat Prix Raisonnement
1914 Max von Laue La physique « Pour sa découverte de la diffraction des rayons X par des cristaux », une étape importante dans le développement de la spectroscopie des rayons X .
1915 William Henry Bragg La physique "Pour leurs services dans l'analyse de la structure cristalline au moyen de rayons X"
William Lawrence Bragg
1962 Max F. Perutz Chimie « pour leurs études des structures des protéines globulaires »
John C. Kendrew
1962 James Dewey Watson Médicament "Pour leurs découvertes concernant la structure moléculaire des acides nucléiques et son importance pour le transfert d'informations dans le matériel vivant"
Francis Harry Compton Crick
Maurice Hugh Frederick Wilkins
1964 Dorothée Hodgkin Chimie "Pour ses déterminations par des techniques aux rayons X des structures de substances biochimiques importantes"
1972 Stanford Moore Chimie "Pour leur contribution à la compréhension du lien entre la structure chimique et l'activité catalytique du centre actif de la molécule de ribonucléase "
William H. Stein
1976 William N. Lipscomb Chimie "Pour ses études sur la structure des boranes éclairant les problèmes de liaison chimique"
1985 Jérôme Karlé Chimie "Pour leurs réalisations exceptionnelles dans le développement de méthodes directes pour la détermination des structures cristallines"
Herbert A. Hauptman
1988 Johann Deisenhofer Chimie « Pour leur détermination de la structure tridimensionnelle d'un centre de réaction photosynthétique »
Hartmut Michel Chimie
Robert Huber Chimie
1997 John E. Walker Chimie "Pour leur élucidation du mécanisme enzymatique sous-jacent à la synthèse de l'adénosine triphosphate (ATP)"
2003 Roderick MacKinnon Chimie « Pour les découvertes concernant les canaux dans les membranes cellulaires [...] pour les études structurales et mécanistiques des canaux ioniques »
Pierre Agré « Pour les découvertes concernant les canaux dans les membranes cellulaires [...] pour la découverte des canaux d'eau »
2006 Roger D. Kornberg Chimie « Pour ses études sur les bases moléculaires de la transcription eucaryote »
2009 Ada E. Yonath Chimie "Pour les études de la structure et de la fonction du ribosome "
Thomas A. Steitz
Venkatraman Ramakrishnan
2012 Brian Kobilka Chimie "Pour les études des récepteurs couplés aux protéines G "

Applications

La diffraction des rayons X a des applications larges et diverses dans les sciences chimiques, biochimiques, physiques, des matériaux et minéralogiques. Laue a affirmé en 1937 que la technique « a étendu le pouvoir d'observer une structure minuscule dix mille fois au-delà de celui que nous donne le microscope ». La diffraction des rayons X est analogue à un microscope avec une résolution au niveau atomique qui montre les atomes et leur distribution électronique.

La diffraction des rayons X, la diffraction des électrons et la diffraction des neutrons donnent des informations sur la structure de la matière, cristalline et non cristalline, au niveau atomique et moléculaire. De plus, ces méthodes peuvent être appliquées à l'étude des propriétés de tous les matériaux, inorganiques, organiques ou biologiques. En raison de l'importance et de la variété des applications des études de diffraction des cristaux, de nombreux prix Nobel ont été décernés pour de telles études.

Identification du médicament

La diffraction des rayons X a été utilisée pour l'identification d'antibiotiques tels que : huit β-lactamines ( ampicilline sodique , pénicilline G procaïne , céfalexine , ampicilline trihydratée, benzathine pénicilline , benzylpénicilline sodique , céfotaxime sodique , Ceftriaxone sodique ), trois tétracyclines ( doxycycline chlorhydrate , oxytétracycline déshydratée , chlorhydrate de tétracycline ) et deux antibiotiques macrolides ( azithromycine , estolate d' érythromycine ). Chacun de ces médicaments a un modèle unique de diffraction des rayons X (XRD) qui rend leur identification possible.

Caractérisation des nanomatériaux, fibres textiles et polymères

L'examen médico-légal de toute trace de preuve est basé sur le principe d'échange de Locard . Celui-ci précise que « chaque contact laisse une trace ». En pratique, même si un transfert de matériel a eu lieu, il peut être impossible à détecter, car le montant transféré est très faible.

XRD a prouvé son rôle dans l'avancement de la recherche sur les nanomatériaux. C'est l'un des principaux outils de caractérisation et fournit des informations sur les propriétés structurelles de divers nanomatériaux sous forme de poudre et de film mince.

Les fibres textiles sont un mélange de substances cristallines et amorphes. Par conséquent, la mesure du degré de cristallinité donne des données utiles dans la caractérisation des fibres par diffractométrie des rayons X. Il a été rapporté que la diffraction des rayons X a été utilisée pour identifier un dépôt "cristallin" qui a été trouvé sur une chaise. Le dépôt s'est avéré amorphe, mais le diagramme de diffraction présent correspondait à celui du polyméthacrylate de méthyle. La spectrométrie de masse par pyrolyse a plus tard identifié le dépôt comme étant de la polyméthylcyanoacrylaon des paramètres cristallins de Boin.

Enquête sur les os

Le chauffage ou la combustion des os provoque des changements reconnaissables dans le minéral osseux qui peuvent être détectés à l'aide de techniques XRD. Au cours des 15 premières minutes de chauffage à 500 °C ou plus, les cristaux osseux ont commencé à changer. À des températures plus élevées, l'épaisseur et la forme des cristaux d'os semblent stabilisées, mais lorsque les échantillons ont été chauffés à une température plus basse ou pendant une période plus courte, les traces XRD ont montré des changements extrêmes dans les paramètres cristallins.

Circuits intégrés

La diffraction des rayons X a été démontrée comme une méthode pour étudier la structure complexe des circuits intégrés .

Voir également

Les références

Lectures complémentaires

Tables internationales pour la cristallographie

  • Théo Hahn, éd. (2002). Tables internationales pour la cristallographie. Volume A, Espace-groupe Symétrie (5e éd.). Dordrecht : Kluwer Academic Publishers , pour l' Union internationale de cristallographie . ISBN 0-7923-6590-9.
  • Michael G. Rossmann ; Eddy Arnold, éd. (2001). Tables internationales pour la cristallographie. Volume F, Cristallographie des molécules biologiques . Dordrecht : Kluwer Academic Publishers, pour l'Union internationale de cristallographie. ISBN 0-7923-6857-6.
  • Théo Hahn, éd. (1996). Tables internationales pour la cristallographie. Brève édition d'enseignement du volume A, Space-group Symetry (4e éd.). Dordrecht : Kluwer Academic Publishers, pour l'Union internationale de cristallographie. ISBN 0-7923-4252-6.

Collections reliées d'articles

Manuels

Analyse de données informatiques appliquées

  • Young, RA, éd. (1993). La méthode Rietveld . Oxford : Oxford University Press et Union internationale de cristallographie. ISBN 0-19-855577-6.

Historique

  • Bijvoet JM ; GT sur les hamburgers ; Hägg G; éd. (1969). Premiers articles sur la diffraction des rayons X par les cristaux . je . Utrecht : publié pour l'Union Internationale de Cristallographie par A. Oosthoek's Uitgeversmaatschappij NVCS1 maint : texte supplémentaire : liste des auteurs ( lien )
  • Bijvoet JM; GT sur les hamburgers ; Hägg G, éd. (1972). Premiers articles sur la diffraction des rayons X par les cristaux . II . Utrecht : publié pour l'Union Internationale de Cristallographie par A. Oosthoek's Uitgeversmaatschappij NV
  • Bragg WL ; Phillips DC & Lipson H (1992). Le développement de l'analyse aux rayons X . New York : Douvres. ISBN 0-486-67316-2.
  • Ewald, PP ; et de nombreux cristallographes, éd. (1962). Cinquante ans de diffraction des rayons X . Utrecht : publié pour l'Union internationale de cristallographie par A. Oosthoek's Uitgeversmaatschappij NV doi : 10.1007/978-1-4615-9961-6 . ISBN 978-1-4615-9963-0.
  • Ewald, PP, éditeur 50 Years of X-Ray Diffraction (Réimprimé au format pdf pour le XVIIIe Congrès de l'IUCr, Glasgow, Écosse, Union internationale de cristallographie).
  • Friedrich W (1922). "Die Geschichte der Auffindung der Röntgenstrahlinterferenzen" . Die Naturwissenschaften . 10 (16): 363. bibcode : 1922NW ..... 10..363F . doi : 10.1007/BF01565289 . S2CID  28141506 .
  • Lonsdale, K (1949). Cristaux et rayons X . New York : D. van Nostrand.
  • "Les structures de la vie". Département américain de la Santé et des Services sociaux. 2007. Citer le journal nécessite |journal=( aide )

Liens externes

Tutoriels

Bases de données primaires

Bases de données dérivées

Validation structurelle