Électrophorèse d'affinité - Affinity electrophoresis
L'électrophorèse d'affinité est un nom général pour de nombreuses méthodes analytiques utilisées en biochimie et biotechnologie . Des informations qualitatives et quantitatives peuvent être obtenues par électrophorèse d'affinité. Les procédés comprennent ce que l'on appelle le test de déplacement de mobilité électrophorétique , l'électrophorèse de déplacement de charge et l'électrophorèse capillaire d' affinité . Les méthodes sont basées sur des modifications du schéma électrophorétique des molécules (principalement des macromolécules ) par interaction biospécifique ou formation de complexes . L'interaction ou la liaison d'une molécule, chargée ou non, modifiera normalement les propriétés électrophorétiques d'une molécule. Les protéines membranaires peuvent être identifiées par un changement de mobilité induit par un détergent chargé . Les acides nucléiques ou les fragments d'acide nucléique peuvent être caractérisés par leur affinité pour d'autres molécules. Les procédés ont été utilisés pour l'estimation des constantes de liaison , comme par exemple dans l' électrophorèse d'affinité de la lectine ou la caractérisation de molécules avec des caractéristiques spécifiques telles que la teneur en glycane ou la liaison au ligand . Pour les enzymes et autres protéines de liaison au ligand, une électrophorèse unidimensionnelle similaire à une contre-électrophorèse ou à une "immunoélectrophorèse de fusée" , une électrophorèse d'affinité peut être utilisée comme une autre quantification de la protéine. Certaines des méthodes sont similaires à la chromatographie d'affinité en utilisant des ligands immobilisés .
Types et méthodes
Actuellement, des recherches sont en cours pour développer de nouvelles façons d'utiliser les connaissances déjà associées à l'électrophorèse d'affinité pour améliorer sa fonctionnalité et sa vitesse, ainsi que des tentatives pour améliorer des méthodes déjà établies et les adapter à l'exécution de tâches spécifiques.
Électrophorèse sur gel d'agarose
Un type d'essai de déplacement de mobilité électrophorétique (AMSA), l'électrophorèse sur gel d'agarose est utilisée pour séparer les complexes d'acides aminés liés aux protéines des acides aminés libres. En utilisant une basse tension (~ 10 V / cm) pour minimiser le risque de dommages causés par la chaleur, l'électricité passe à travers un gel d'agarose.
Électrophorèse rapide sur gel d'agarose
Cette technique utilise une haute tension ( ≥ 20 V / cm ) avec un tampon Tris-borate 0,5 x exécuté sur un gel d'agarose. Cette méthode diffère de l'électrophorèse sur gel d'agarose traditionnelle en utilisant une tension plus élevée pour faciliter un temps d'exécution plus court ainsi que pour produire une résolution de bande plus élevée. D'autres facteurs inclus dans le développement de la technique d'électrophorèse rapide sur gel d'agarose sont l'épaisseur du gel et le pourcentage d'agarose dans le gel.
Électrophorèse d'affinité au boronate
L'électrophorèse d'affinité au boronate utilise des gels d'acrylamide infusés d'acide boronique pour purifier l'ARN-NAD. Cette purification permet aux chercheurs de mesurer facilement l'activité cinétique des enzymes de décapage NAD-ARN.
Électrophorèse capillaire d'affinité
L'électrophorèse capillaire d'affinité (ACE) fait référence à un certain nombre de techniques qui reposent sur des interactions de liaison spécifiques et non spécifiques pour faciliter la séparation et la détection par une approche de formulaire conformément à la théorie de l' électromigration . En utilisant les interactions intermoléculaires entre molécules se produisant en solution libre ou mobilisées sur un support solide, l'ACE permet la séparation et la quantification des concentrations d'analyte et des constantes de liaison et de dissociation entre les molécules. Avec l'ACE, les scientifiques espèrent développer des candidats-médicaments à forte liaison, comprendre et mesurer l'activité enzymatique et caractériser les charges sur les protéines. L'électrophorèse capillaire d'affinité peut être divisée en trois techniques distinctes: électrophorèse hors équilibre de mélanges d'échantillons équilibrés, ACE à équilibre dynamique et ACE basé sur l'affinité.
L'électrophorèse hors équilibre de mélanges d'échantillons équilibrés est généralement utilisée dans la séparation et l'étude des interactions de liaison de grandes protéines et implique la combinaison à la fois de l'analyte et de sa molécule réceptrice dans un échantillon prémélangé. Ces molécules réceptrices prennent souvent la forme de sondes d'affinité constituées de molécules marquées au fluorophore qui se lieront à des molécules cibles qui sont mélangées à l'échantillon testé. Ce mélange et ses complexes ultérieurs sont ensuite séparés par électrophorèse capillaire. Parce que le mélange original d'analyte et de molécule réceptrice étaient liés ensemble dans un équilibre, la lente dissociation de ces deux molécules liées au cours de l'expérience électrophorétique entraînera leur séparation et un déplacement ultérieur de l'équilibre vers une dissociation supplémentaire. Le motif de frottis caractéristique produit par la libération lente de l'analyte du complexe pendant l'expérience peut être utilisé pour calculer la constante de dissociation du complexe.
L'ECA à l'équilibre dynamique implique la combinaison de l'analyte trouvé dans l'échantillon et de sa molécule réceptrice trouvée dans la solution tamponnée dans le tube capillaire de sorte que la liaison et la séparation se produisent uniquement dans l'instrument. On suppose que pour l'électrophorèse capillaire d'affinité à équilibre dynamique, la liaison ligand-récepteur se produit rapidement lorsque l'analyte et le tampon sont mélangés. Les constantes de liaison sont généralement dérivées de cette technique sur la base du décalage de migration de pic du récepteur qui dépend de la concentration de l'analyte dans l'échantillon.
L'électrophorèse capillaire basée sur l'affinité, également connue sous le nom de chromatographie d'électroaffinité capillaire (CEC), implique la liaison de l'analyte dans l'échantillon à une molécule réceptrice immobilisée sur la paroi capillaire, des microbilles ou des microcanaux. CEC offre la plus grande efficacité de séparation des trois techniques ACE car les composants non matricés de l'échantillon sont éliminés par lavage et le ligand est ensuite libéré et analysé.
L'électrophorèse capillaire d'affinité tire parti des avantages de l'électrophorèse capillaire et les applique à l'étude des interactions protéiques. L'ACE est avantageuse car elle a une efficacité de séparation élevée, une durée d'analyse plus courte, peut être exécutée à un pH physiologique et implique une faible consommation de ligand / molécules. De plus, la composition de la protéine d'intérêt n'a pas à être connue pour mener des études ACE. Le principal inconvénient, cependant, est qu'il ne donne pas beaucoup d'informations stoechiométriques sur la réaction étudiée.
Électrophorèse sur gel de polyacrylamide Affinity-Trap
L'électrophorèse sur gel de polyacrylamide Affinity-trap (PAGE) est devenue l'une des méthodes les plus populaires de séparation des protéines. Ceci n'est pas seulement dû à ses qualités de séparation, mais aussi parce qu'il peut être utilisé en conjonction avec une variété d'autres méthodes analytiques, telles que la spectrométrie de masse et le transfert de Western. Cette méthode utilise une approche en deux étapes. Tout d'abord, un échantillon de protéines est passé à travers un gel de polyacrylamide par électrophorèse. Ensuite, l'échantillon est transféré dans un gel de polyacrylamide différent (le gel de piège d'affinité) où les sondes d'affinité sont immobilisées. Les protéines qui n'ont pas d'affinité pour les sondes d'affinité passent à travers le gel de piège d'affinité, et les protéines ayant une affinité pour les sondes seront "piégées" par les sondes d'affinité immobiles. Ces protéines piégées sont ensuite visualisées et identifiées à l'aide de la spectrométrie de masse après digestion en gel.
Électrophorèse d'affinité aux phosphates
L'électrophorèse d'affinité au phosphate utilise une sonde d'affinité qui consiste en une molécule qui se lie spécifiquement aux ions phosphate divalents en solution aqueuse neutre, connue sous le nom de «Phos-Tag». Ce procédé utilise également un gel de séparation constitué d'un monomère Phos-Tag pendant l'acrylamide qui est copolymérisé. Les protéines phosphorylées migrent lentement dans le gel par rapport aux protéines non phosphorylées. Cette technique permet au chercheur d'observer les différences dans les états de phosphorylation d'une protéine donnée.