Fluorescence de la chlorophylle - Chlorophyll fluorescence

Un extrait de chlorophylle dans l'alcool montré sous lumière blanche (ci-dessus) et fluorescence induisant une lumière UV (ci-dessous).

Images microscopiques d'une feuille de mousse de Plagiomnium undulatum . Microscopie à fond clair en haut et microscopie à fluorescence en bas. La fluorescence rouge provient de la chlorophylle des chloroplastes.

La fluorescence de la chlorophylle est la lumière réémise par les molécules de chlorophylle lors du retour des états excités aux états non excités . Il est utilisé comme indicateur de la conversion d'énergie photosynthétique chez les plantes , les algues et les bactéries . La chlorophylle excitée dissipe l'énergie lumineuse absorbée en entraînant la photosynthèse (conversion d'énergie photochimique), sous forme de chaleur lors d' une extinction non photochimique ou par émission sous forme de rayonnement de fluorescence. Comme ces processus sont des processus complémentaires, l'analyse de la fluorescence de la chlorophylle est un outil important dans la recherche sur les plantes avec un large éventail d'applications.

L'effet Kautsky

Lors de l'illumination d'une feuille adaptée à l'obscurité, il y a une augmentation rapide de la fluorescence du photosystème II (PSII), suivie d'un lent déclin. Observé pour la première fois par Kautsky et al., 1932 , c'est ce qu'on appelle l'effet Kautsky. Cette augmentation variable de l'augmentation de la fluorescence de la chlorophylle est due au photosystème II. La fluorescence du photosystème I n'est pas variable, mais constante.

L'augmentation de la fluorescence est due au fait que les centres de réaction PSII sont dans un état "fermé" ou chimiquement réduit. Les centres de réaction sont "fermés" lorsqu'ils sont incapables d'accepter d'autres électrons. Cela se produit lorsque les accepteurs d'électrons en aval de PSII n'ont pas encore transmis leurs électrons à un porteur d'électrons ultérieur, et sont donc incapables d'accepter un autre électron. Les centres de réaction fermés réduisent l'efficacité photochimique globale et augmentent ainsi le niveau de fluorescence. Le transfert d'une feuille de l'obscurité à la lumière augmente la proportion de centres de réaction PSII fermés, de sorte que les niveaux de fluorescence augmentent pendant 1 à 2 secondes. Par la suite, la fluorescence diminue en quelques minutes. Cela est dû à; 1. plus "d'extinction photochimique" dans laquelle les électrons sont transportés loin du PSII en raison d'enzymes impliquées dans la fixation du carbone ; et 2. plus de « trempe non photochimique » dans laquelle plus d'énergie est convertie en chaleur.

Mesurer la fluorescence

Habituellement, la mesure initiale est le niveau minimal de fluorescence, . C'est la fluorescence en l'absence de lumière photosynthétique. ${\style d'affichage \,F_{0}}$

Pour utiliser des mesures de fluorescence de la chlorophylle pour analyser la photosynthèse, les chercheurs doivent faire la distinction entre l' extinction photochimique et l'extinction non photochimique (dissipation thermique). Ceci est réalisé en arrêtant la photochimie, ce qui permet aux chercheurs de mesurer la fluorescence en présence d'une extinction non photochimique seule. Pour réduire l'extinction photochimique à des niveaux négligeables, un flash lumineux court de haute intensité est appliqué sur la feuille. Cela ferme temporairement tous les centres de réaction PSII, ce qui empêche l'énergie de PSII d'être transmise aux porteurs d'électrons en aval. L'extinction non photochimique ne sera pas affectée si le flash est court. Pendant le flash, la fluorescence atteint le niveau atteint en l'absence de toute extinction photochimique, appelé fluorescence maximale . ${\style d'affichage \,F_{m}}$

L'efficacité de la trempe photochimique (qui est une approximation de l'efficacité du PSII) peut être estimée en comparant le rendement constant de fluorescence dans la lumière et le rendement de fluorescence en l'absence de lumière photosynthétique . L'efficacité de la trempe non photochimique est altérée par divers facteurs internes et externes. Les altérations de la dissipation thermique signifient des changements de . La dissipation de chaleur ne peut pas être totalement arrêtée, de sorte que le rendement de fluorescence de la chlorophylle en l'absence d'extinction non photochimique ne peut pas être mesuré. Par conséquent, les chercheurs utilisent un point adapté à l'obscurité ( ) avec lequel comparer les estimations d'extinction non photochimique. ${\style d'affichage \,F_{m}}$${\style d'affichage \,F_{t}}$${\style d'affichage \,F_{0}}$${\style d'affichage \,F_{m}}$${\displaystyle F_{m}^{0}}$

Paramètres de fluorescence communs

${\style d'affichage \,F_{0}}$: Fluorescence minimale (unités arbitraires). Niveau de fluorescence de l'échantillon adapté à l'obscurité lorsque tous les centres de réaction du photosystème II sont ouverts.

${\style d'affichage \,F_{m}}$: Fluorescence maximale (unités arbitraires). Niveau de fluorescence de l'échantillon adapté à l'obscurité lorsqu'une impulsion de haute intensité a été appliquée. Tous les centres réactionnels du photosystème II sont fermés.

${\style d'affichage \,{F_{0}}'}$: Fluorescence minimale (unités arbitraires). Niveau de fluorescence de l'échantillon adapté à la lumière lorsque tous les centres de réaction du photosystème II sont ouverts ; il est abaissé par rapport à par trempe non photochimique. ${\style d'affichage \,F_{0}}$

${\style d'affichage \,{F_{m}}'}$: Fluorescence maximale (unités arbitraires). Niveau de fluorescence de l'échantillon adapté à la lumière lorsqu'une impulsion de haute intensité a été appliquée. Tous les centres réactionnels du photosystème II sont fermés.

${\style d'affichage \,F_{t}}$: Fluorescence terminale à l'état d'équilibre (unités arbitraires). Un niveau de fluorescence à l'état d'équilibre a diminué (= éteint) par des processus photochimiques et non photochimiques.

${\style d'affichage \,T_{1/2}}$: Demi temps de montée de à . ${\style d'affichage \,F_{0}}$${\style d'affichage \,F_{m}}$

Paramètres calculés

${\style d'affichage \,F_{v}}$est une fluorescence variable. Calculé comme = - . ${\style d'affichage \,F_{v}}$${\style d'affichage \,F_{m}}$${\style d'affichage \,F_{0}}$

${\displaystyle {\tfrac {F_{v}}{F_{m}}}}$est le rapport de la fluorescence variable à la fluorescence maximale. Calculé comme . Il s'agit d'une mesure de l'efficacité maximale du PSII (l'efficacité si tous les centres PSII étaient ouverts). peut être utilisé pour estimer l'efficacité potentielle du PSII en prenant des mesures adaptées à l'obscurité. ${\style d'affichage {\frac {F_{m}-F_{0}}{F_{m}}}}$${\displaystyle {\tfrac {F_{v}}{F_{m}}}}$

${\displaystyle \,\Phi _{PSII}}$mesure l'efficacité du photosystème II. Calculé comme = . Ce paramètre mesure la proportion de lumière absorbée par le PSII qui est utilisée en photochimie. En tant que tel, il peut donner une mesure du taux de transport linéaire des électrons et indique ainsi la photosynthèse globale. ${\style d'affichage \,Y_{(II)}}$${\displaystyle ,{\frac {{F_{m}}'-F_{t}}{{F_{m}}'}}}$

${\style d'affichage \,qP}$(trempe photochimique). Calculé comme . Ce paramètre se rapproche de la proportion de centres de réaction PSII qui sont ouverts. ${\displaystyle \,{\frac {{F_{m}}'-F_{t}}{{F_{m}}'-{F_{0}}'}}}$

Tout en donnant une estimation de l'efficacité, et nous dire quels processus ont altéré l'efficacité. La fermeture des centres de réaction à la suite d'une lumière à haute intensité modifiera la valeur de . Des changements dans l'efficacité de la trempe non photochimique modifieront le rapport . ${\displaystyle \,\Phi _{PSII}}$${\style d'affichage \,qP}$${\displaystyle {\tfrac {F_{v}}{F_{m}}}}$${\style d'affichage \,qP}$${\displaystyle {\tfrac {F_{v}}{F_{m}}}}$

Applications de la théorie

Rendement PSII comme mesure de la photosynthèse

La fluorescence de la chlorophylle semble être une mesure de la photosynthèse, mais c'est une simplification excessive. La fluorescence peut mesurer l'efficacité de la photochimie PSII, qui peut être utilisée pour estimer le taux de transport linéaire des électrons en multipliant par l'intensité lumineuse. Cependant, les chercheurs parlent généralement de fixation du carbone lorsqu'ils font référence à la photosynthèse. Le transport des électrons et la fixation du CO ₂ peuvent être bien corrélés, mais peuvent ne pas être corrélés sur le terrain en raison de processus tels que la photorespiration, le métabolisme de l'azote et la réaction de Mehler .

Relation entre le transport d'électrons et la fixation du carbone

Une technique de recherche puissante consiste à mesurer simultanément la fluorescence de la chlorophylle et les échanges gazeux pour obtenir une image complète de la réponse des plantes à leur environnement. Une technique consiste à mesurer simultanément la fixation du CO ₂ et la photochimie du PSII à différentes intensités lumineuses, dans des conditions non photorespiratoires. Un graphique de la fixation du CO ₂ et de la photochimie PSII indique le besoin en électrons par molécule de CO ₂ fixée. A partir de cette estimation, l'étendue de la photorespiration peut être estimée. Cela a été utilisé pour explorer l'importance de la photorespiration en tant que mécanisme photoprotecteur pendant la sécheresse.

L'analyse de fluorescence peut également être appliquée à la compréhension des effets des températures basses et élevées.

• Sobrado (2008) a étudié les échanges gazeux et les réponses de fluorescence de la chlorophylle a à une lumière de haute intensité, d'espèces pionnières et d'espèces forestières. Les échanges gazeux foliaires à midi ont été mesurés à l'aide d'un système de photosynthèse , qui mesurait le taux net de photosynthèse, la gs et la concentration de CO ₂ intercellulaire ( ). Dans les mêmes feuilles utilisées pour les mesures des échanges gazeux, les paramètres de fluorescence de la chlorophylle a (initiale, maximale et variable, ) ont été mesurés à l'aide d'un fluoromètre. Les résultats ont montré que malgré les espèces pionnières et les espèces forestières occupant des habitats différents, les deux présentaient une vulnérabilité similaire à la photoinhibition de midi dans les feuilles exposées au soleil.${\style d'affichage C_{i}}$${\style d'affichage \,F_{0}}$${\style d'affichage \,F_{m}}$${\style d'affichage \,F_{v}}$

Mesurer le stress et la tolérance au stress

La fluorescence de la chlorophylle peut mesurer la plupart des types de stress des plantes . La fluorescence de la chlorophylle peut être utilisée comme indicateur du stress des plantes car les stress environnementaux, par exemple les températures extrêmes, la lumière et la disponibilité en eau, peuvent réduire la capacité d'une plante à se métaboliser normalement. Cela peut signifier un déséquilibre entre l'absorption d'énergie lumineuse par la chlorophylle et l'utilisation d'énergie dans la photosynthèse.

• Favaretto et al. (2010) ont étudié l'adaptation à un environnement lumineux intense chez des espèces pionnières et tardives, cultivées sous 100 % et 10 % de lumière. De nombreux paramètres, dont la fluorescence de la chlorophylle a , ont été mesurés. Un déclin plus important de la lumière en plein soleil chez les espèces de fin de succession que chez les espèces pionnières a été observé. Dans l'ensemble, leurs résultats montrent que les espèces pionnières fonctionnent mieux sous une lumière solaire intense que les espèces de fin de succession, ce qui suggère que les plantes pionnières ont une plus grande tolérance potentielle aux dommages photo-oxydatifs.${\displaystyle {\tfrac {F_{v}}{F_{m}}}}$

• Neocleous et Vasilakakis (2009) ont étudié la réponse de la framboise au stress dû au bore et au sel . Un fluoromètre à chlorophylle a été utilisé pour mesurer , et . La fluorescence de la chlorophylle des feuilles n'était pas significativement affectée par la concentration de NaCl lorsque la concentration de B était faible. Lorsque B était augmenté, la fluorescence de la chlorophylle des feuilles était réduite dans des conditions salines. On pourrait conclure que l'effet combiné du B et du NaCl sur les framboises induit un effet toxique sur les paramètres photochimiques.${\style d'affichage \,F_{0}}$${\style d'affichage \,F_{m}}$${\style d'affichage \,F_{v}}$
• Lu et Zhang (1999) ont étudié le stress thermique chez les plants de blé et ont découvert que la stabilité de la température dans le photosystème II des feuilles stressées par l'eau est corrélée positivement à la résistance du métabolisme pendant la photosynthèse.

Indice de bilan d'azote

Exemple de fluorimètre multiparamétrique portable qui utilise le rapport entre la chlorophylle et les flavonols pour détecter la carence en azote des plantes

En raison du lien entre la teneur en chlorophylle et la teneur en azote dans les feuilles, les fluorimètres à chlorophylle peuvent être utilisés pour détecter les carences en azote chez les plantes, par plusieurs méthodes .

Sur la base de plusieurs années de recherche et d'expérimentation, les polyphénols peuvent être les indicateurs du statut azoté d'une plante. Par exemple, lorsqu'une plante est dans des conditions optimales, elle favorise son métabolisme primaire et synthétise les protéines (molécules d'azote) contenant de la chlorophylle, et peu de flavonols (composés secondaires carbonés). Par contre, en cas de manque d'azote, on observera une production accrue de flavonols par la plante.

Le NBI (Nitrogen Balance Index) de Force-A, permet d'évaluer les conditions azotées d'une culture en calculant le rapport entre Chlorophylle et Flavonols (lié à l'allocation Azote/Carbone).

Mesurer la teneur en chlorophylle

Gitelson (1999) déclare : « Le rapport entre la fluorescence de la chlorophylle à 735 nm et la plage de longueurs d'onde de 700 nm à 710 nm, F735/F700 s'est avéré linéairement proportionnel à la teneur en chlorophylle (avec un coefficient de détermination, r2, supérieur à 0,95) et donc ce rapport peut être utilisé comme un indicateur précis de la teneur en chlorophylle dans les feuilles des plantes."

Fluoromètres à chlorophylle

Image de fluorescence (valeur Ft) de la surface foliaire adaxiale

Le développement des fluorimètres a permis à l'analyse de fluorescence de la chlorophylle de devenir une méthode courante dans la recherche sur les plantes. L'analyse de fluorescence de la chlorophylle a été révolutionnée par l'invention de la technique de modulation d'amplitude d'impulsion (PAM) et la disponibilité du premier fluoromètre de chlorophylle modulé commercial PAM-101 (Walz, Allemagne). En modulant le faisceau lumineux de mesure (impulsions de la plage de la microseconde) et en détectant en parallèle la fluorescence excitée, le rendement relatif de fluorescence (Ft) peut être déterminé en présence de lumière ambiante. Surtout, cela signifie que la fluorescence de la chlorophylle peut être mesurée sur le terrain même en plein soleil.

Aujourd'hui, les fluorimètres à chlorophylle sont conçus pour mesurer de nombreux mécanismes végétaux différents. Les protocoles de mesure : F _V /F _M et OJIP mesurent l'efficacité des échantillons du Photosystème II à un état adapté à l'obscurité commun et connu. Ces protocoles sont utiles pour mesurer de nombreux types de stress chez les plantes. Le protocole de mesure adapté à la lumière de Bernard Genty MF/F _M ', ou Y(II), est un moyen efficace et sensible de mesurer des échantillons de plantes dans des conditions d'éclairage ambiant ou artificiel. Cependant, étant donné que les valeurs Y(II) changent également avec l'intensité lumineuse, il convient de comparer des échantillons à la même intensité lumineuse, à moins que la contrainte lumineuse ne soit au centre de la mesure. Y(II) peut être plus sensible à certains types de stress des plantes que F _V /F _M , comme le stress thermique.

D'autres protocoles de mesure des mécanismes végétaux ont également été développés. Lorsqu'un chloroplaste absorbe de la lumière, une partie de l'énergie lumineuse va à la photochimie, une partie à la dissipation thermique régulée et une autre à la dissipation thermique non régulée. Divers paramètres de mesure de la fluorescence de la chlorophylle existent pour mesurer tous ces événements. Dans le modèle du lac, q _L mesure l'extinction photochimique, Y(NYO) mesure la dissipation thermique régulée par la plante et Y(NO) mesure la dissipation thermique non régulée. Un protocole de trempe plus ancien, appelé modèle de flaque, utilise q _P pour la trempe photochimique, q _N pour la trempe non photochimique de la dissipation thermique régulée et non régulée et NPQ pour une estimation de la trempe non photochimique. NPQ a également été ressuscité au modèle du lac mathématiquement.

De plus, les paramètres q _E et pNPQ ont été développés pour mesurer le cycle photoprotecteur de la xanthophylle. q _T est une mesure des transitions d'état. q _M est une mesure de la migration des chloroplastes et q _I est une mesure de la photoinhibition des plantes.

À des niveaux de lumière actinique inférieurs NPQ = qE+qT+qI

À des niveaux de lumière actinique élevés NPQ = qE+qM=qI

Certains fluorimètres sont conçus pour être portables et utilisés d'une seule main.

Le développement constant des fluorimètres d'imagerie facilite la visualisation des hétérogénéités spatiales dans l'activité photosynthétique des échantillons. Ces hétérogénéités se produisent naturellement dans les feuilles des plantes par exemple lors de croissances, de divers stress environnementaux ou d'infection par des agents pathogènes. Ainsi, la connaissance des hétérogénéités des échantillons est importante pour une interprétation correcte des performances photosynthétiques de l'échantillon de plante. Les systèmes fluorimétriques d'imagerie hautes performances offrent des options pour analyser une seule cellule/un seul chloroplaste ainsi que des zones d'échantillonnage couvrant des feuilles ou des plantes entières.

Approches alternatives

Capteurs FRV

Les techniques basées sur l'effet Kautsky n'épuisent pas la variété des méthodes de détection et d'évaluation basées sur la fluorescence de la chlorophylle. En particulier, les avancées récentes dans le domaine de la fluorescence induite par laser (LIF) offrent également l'opportunité de développer des capteurs suffisamment compacts et efficaces pour l'évaluation de l'état photophysiologique et de la biomasse. Au lieu de mesurer l'évolution du flux de fluorescence total, de tels capteurs enregistrent la densité spectrale de ce flux excité par de fortes impulsions lumineuses laser monochromatiques d'une durée de quelques nanosecondes. Ne nécessitant aucune période d'adaptation à l'obscurité de 15 à 20 minutes (comme c'est le cas pour les méthodes à effet Kautsky) et étant capables d'exciter l'échantillon à une distance considérable, les capteurs LIF peuvent fournir une évaluation rapide et à distance.

• L' application de la technique LIF à l' évaluation du stress hydrique chez le chêne - liège ( Quercus suber ) et le pin maritime ( Pinus pinaster ) sur la base du rapport d' émission de chlorophylle I ₆₈₅ / I ₇₄₀ est décrite dans la Réf. Récemment, la technique de détection LIF a été exploitée pour étudier le rôle de la protéine pPLAIIα dans la protection du métabolisme photosynthétique pendant le stress hydrique en utilisant des plantes d'Arabidopsis génétiquement modifiées.

• En 2011, Vieira et al. a appliqué un capteur LIF compact à faible coût (construit autour d'un laser Nd:YAG à commutation Q à semi-conducteurs doublé en fréquence et d'un spectromètre à fibre optique miniature commercial spécialement modifié Ocean Optics USB4000) pour étudier les communautés microphytobenthos intertidales. L'émission de chlorophylle a permis aux chercheurs d'évaluer adéquatement la biomasse de surface et de suivre les rythmes migratoires des microalgues benthiques épipéliques dans les sédiments boueux.

Voir également

• Fluoromètre intégré pour les échanges gazeux et la fluorescence chlorophyllienne des feuilles
• Trempe non photochimique
• Fluorescence induite par le soleil
• [1]

Fluorimètre de chlorophylle à excitation continue avancée

Les références

Liens externes

• Lazar (1999). "Induction de fluorescence de la chlorophylle a" . Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioénergétique . 1412 (1) : 1–28. doi : 10.1016/s0005-2728(99)00047-x . PMID  10354490 .
• Lazar (2006). "La chlorophylle polyphasique a une élévation de fluorescence mesurée sous haute intensité de lumière excitante" . Biologie végétale fonctionnelle . 33 : 9-30. doi : 10.1071/fp05095 .
• Lazar (2015). "Paramètres de partitionnement de l'énergie photosynthétique" . Journal de physiologie végétale . 175 : 131-147. doi : 10.1016/j.jplph.2014.10.021 . PMID  25569797 .
• Kalaji ; et al. (2012). « Mesures expérimentales in vivo de l'émission lumineuse chez les plantes : une perspective dédiée à David Walker ». Recherche sur la photosynthèse . 114 (2) : 69-96. doi : 10.1007/s11120-012-9780-3 . PMID  23065335 .
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• Murchie et Lawson (2013). "Analyse par fluorescence de la chlorophylle : un guide de bonnes pratiques et de compréhension de quelques nouvelles applications" . Journal de botanique expérimentale . 64 (13) : 3983–3998. doi : 10.1093/jxb/ert208 . PMID  23913954 .