Agarose - Agarose
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L'agarose est un polysaccharide , généralement extrait de certaines algues rouges . Il s'agit d'un polymère linéaire constitué de l'unité répétitive d'agarobiose, qui est un disaccharide composé de D- galactose et de 3,6-anhydro- L- galactopyranose. L'agarose est l'un des deux composants principaux de la gélose et est purifié à partir de la gélose en éliminant l'autre composant de la gélose, l' agaropectine .
L'agarose est fréquemment utilisé en biologie moléculaire pour la séparation de grosses molécules, en particulier l' ADN , par électrophorèse . Des plaques de gels d'agarose (généralement 0,7 à 2 %) pour l'électrophorèse sont facilement préparées en versant la solution liquide chaude dans un moule. Une large gamme d'agaroses différents de poids moléculaires et de propriétés variables est disponible dans le commerce à cet effet. L'agarose peut également être transformé en billes et utilisé dans un certain nombre de méthodes chromatographiques pour la purification des protéines .
Structure
L'agarose est un polymère linéaire d'un poids moléculaire d'environ 120 000, constitué d'une alternance de D - galactose et de 3,6-anhydro- L- galactopyranose liés par des liaisons glycosidiques -(1→3) et -(1→4). Le 3,6-anhydro- L- galactopyranose est un L- galactose avec un pont anhydro entre les positions 3 et 6, bien que certaines unités L- galactose dans le polymère puissent ne pas contenir le pont. Certaines unités D- galactose et L- galactose peuvent être méthylées , et le pyruvate et le sulfate se trouvent également en petites quantités.
Chaque chaîne d'agarose contient environ 800 molécules de galactose, et les chaînes polymères d'agarose forment des fibres hélicoïdales qui s'agrègent en une structure superenroulée avec un rayon de 20-30 nm . Les fibres sont quasi-rigides et ont une large gamme de longueur en fonction de la concentration en agarose. Une fois solidifiées, les fibres forment un maillage tridimensionnel de canaux de diamètre allant de 50 nm à > 200 nm selon la concentration d'agarose utilisée - des concentrations plus élevées donnent des diamètres de pores moyens inférieurs. La structure 3-D est maintenue par des liaisons hydrogène et peut donc être perturbée par un retour à l'état liquide.
Propriétés
L'agarose est disponible sous forme de poudre blanche qui se dissout dans l'eau presque bouillante et forme un gel lorsqu'il refroidit. L'agarose présente le phénomène d' hystérésis thermique dans sa transition liquide-gel, c'est-à-dire qu'il se gélifie et fond à différentes températures. Les températures de gélification et de fusion varient selon le type d'agarose. Les agaroses standard dérivés de Gelidium ont une température de gélification de 34 à 38 °C (93 à 100 °F) et une température de fusion de 90 à 95 °C (194 à 203 °F), tandis que celles dérivées de Gracilaria , en raison de leur substituants méthoxy , a une température de gélification de 40 à 52 °C (104 à 126 °F) et une température de fusion de 85 à 90 °C (185 à 194 °F). Les températures de fusion et de gélification peuvent dépendre de la concentration du gel, en particulier à une faible concentration de gel inférieure à 1 %. Les températures de gélification et de fusion sont donc données à une concentration d'agarose spécifiée.
L'agarose naturel contient des groupes méthyle non chargés et l'étendue de la méthylation est directement proportionnelle à la température de gélification. La méthylation synthétique a cependant l'effet inverse, une méthylation accrue abaissant la température de gélification. Une variété d'agaroses chimiquement modifiées avec différentes températures de fusion et de gélification sont disponibles grâce à des modifications chimiques.
L'agarose dans le gel forme un maillage qui contient des pores, et la taille des pores dépend de la concentration d'agarose ajoutée. Au repos, les gels d'agarose sont sujets à la synérèse (extrusion d'eau à travers la surface du gel), mais le processus est suffisamment lent pour ne pas interférer avec l'utilisation du gel.
Le gel d'agarose peut avoir une force de gel élevée à faible concentration, ce qui le rend approprié comme milieu anti-convection pour l'électrophorèse sur gel . Les gels d'agarose aussi dilués que 0,15% peuvent former des plaques pour l'électrophorèse sur gel. Le polymère d'agarose contient des groupements chargés, notamment du pyruvate et du sulfate . Ces groupes chargés négativement peuvent ralentir le mouvement des molécules d'ADN dans un processus appelé électroendosmose (EEO), et l'agarose à faible EEO est donc généralement préféré pour une utilisation dans l'électrophorèse sur gel d' agarose des acides nucléiques . Des agaroses Zero EEO sont également disponibles, mais ils peuvent être indésirables pour certaines applications car ils peuvent être fabriqués en ajoutant des groupes chargés positivement qui peuvent affecter les réactions enzymatiques ultérieures. L'électroendosmose est une raison pour laquelle l'agarose est utilisé de préférence par rapport à la gélose, car l'agaropectine dans la gélose contient une quantité importante de groupes sulfate et carboxyle chargés négativement. L'élimination de l'agaropectine dans l'agarose réduit considérablement l'OEE, ainsi que l'adsorption non spécifique de biomolécules sur la matrice de gel. Cependant, pour certaines applications telles que l'électrophorèse des protéines sériques, un EEO élevé peut être souhaitable, et l'agaropectine peut être ajoutée dans le gel utilisé.
Agaroses à basse température de fusion et de gélification
Les températures de fusion et de gélification de l'agarose peuvent être modifiées par des modifications chimiques, le plus souvent par hydroxyéthylation, ce qui réduit le nombre de liaisons hydrogène intrabrin, entraînant des températures de fusion et de prise inférieures à celles des agaroses standard. La température exacte est déterminée par le degré de substitution, et de nombreux agaroses à bas point de fusion (LMP) disponibles peuvent rester fluides dans une plage de 30 à 35 °C (86 à 95 °F). Cette propriété permet d'effectuer des manipulations enzymatiques directement après l'électrophorèse sur gel d'ADN en ajoutant des tranches de gel fondu contenant le fragment d'ADN d'intérêt à un mélange réactionnel. L'agarose LMP contient moins de sulfates qui peuvent affecter certaines réactions enzymatiques, et est donc de préférence utilisé pour certaines applications. L'hydroxyéthylation peut réduire la taille des pores en réduisant la densité de tassement des faisceaux d'agarose. Par conséquent, le gel LMP peut également avoir un effet sur le temps et la séparation pendant l'électrophorèse. Les agaroses à température de fusion ou de gélification ultra-basse ne peuvent gélifier qu'à 8-15 °C (46-59 °F).
Applications
L'agarose est une matrice préférée pour travailler avec des protéines et des acides nucléiques car il a une large gamme de stabilité physique, chimique et thermique, et son degré inférieur de complexité chimique le rend également moins susceptible d'interagir avec les biomolécules . L'agarose est le plus couramment utilisé comme milieu pour la séparation électrophorétique à l' échelle analytique dans l' électrophorèse sur gel d'agarose . Les gels fabriqués à partir d'agarose purifié ont une taille de pores relativement grande, ce qui les rend utiles pour la séparation de grosses molécules, telles que des protéines et des complexes protéiques > 200 kilodaltons, ainsi que des fragments d'ADN > 100 paires de bases. L'agarose est également largement utilisé pour un certain nombre d'autres applications, par exemple l' immunodiffusion et l' immunoélectrophorèse , car les fibres d'agarose fonctionnent comme un point d'ancrage pour les complexes immuns .
Électrophorèse sur gel d'agarose
L'électrophorèse sur gel d'agarose est la méthode de routine pour la résolution de l' ADN en laboratoire. Agarose gels ont résolvent plus faible puissance pour l' ADN de gels d'acrylamide, mais ils ont une plus grande gamme de séparation, et sont donc généralement utilisés pour les fragments d'ADN avec des longueurs de 50-20,000 pb ( paires de bases ), bien que la résolution de plus de 6 Mb est possible avec pulsé électrophorèse sur gel de terrain (PFGE). Il peut également être utilisé pour séparer de grosses molécules de protéines, et c'est la matrice préférée pour l'électrophorèse sur gel de particules avec des rayons efficaces supérieurs à 5-10 nm.
La taille des pores du gel affecte la taille de l'ADN qui peut être tamisé. Plus la concentration du gel est faible, plus la taille des pores est grande et plus l'ADN pouvant être tamisé est gros. Cependant, les gels à faible concentration (0,1 - 0,2%) sont fragiles et donc difficiles à manipuler, et l'électrophorèse de grosses molécules d'ADN peut prendre plusieurs jours. La limite de résolution pour l'électrophorèse sur gel d'agarose standard est d'environ 750 kb. Cette limite peut être surmontée par PFGE, où des champs électriques orthogonaux alternatifs sont appliqués au gel. Les fragments d'ADN se réorientent lorsque le champ appliqué change de direction, mais les plus grosses molécules d'ADN mettent plus de temps à se réaligner lorsque le champ électrique est modifié, tandis que pour les plus petites, c'est plus rapide, et l'ADN peut donc être fractionné en fonction de la taille.
Les gels d'agarose sont coulés dans un moule et, lorsqu'ils sont fixés, ils sont généralement immergés horizontalement dans une solution tampon. Les tampons Tris-acétate-EDTA et Tris-Borate-EDTA sont couramment utilisés, mais d'autres tampons tels que les tampons Tris-phosphate, acide barbiturique-barbiturique de sodium ou Tris- barbiturique peuvent être utilisés dans d'autres applications. L'ADN est normalement visualisé par coloration au bromure d'éthidium , puis visualisé sous une lumière UV , mais d'autres méthodes de coloration sont disponibles, telles que le SYBR Green , GelRed , le bleu de méthylène et le cristal violet . Si les fragments d'ADN séparés sont nécessaires pour une expérience ultérieure en aval, ils peuvent être découpés du gel en tranches pour une manipulation ultérieure.
Purification des protéines
La matrice de gel d'agarose est souvent utilisée pour la purification des protéines , par exemple, dans la séparation à l'échelle préparative sur colonne comme dans la chromatographie de filtration sur gel , la chromatographie d'affinité et la chromatographie d'échange d'ions . Il n'est cependant pas utilisé sous forme de gel continu, mais plutôt sous forme de billes poreuses ou de résines de finesse variable. Les billes sont très poreuses, de sorte que les protéines peuvent circuler librement à travers les billes. Ces billes à base d'agarose sont généralement molles et faciles à écraser, elles doivent donc être utilisées selon des procédures d'écoulement par gravité, de centrifugation à basse vitesse ou à basse pression. La résistance des résines peut être améliorée par une réticulation accrue et un durcissement chimique des résines d'agarose, mais de tels changements peuvent également entraîner une capacité de liaison plus faible pour les protéines dans certaines procédures de séparation telles que la chromatographie d'affinité .
L'agarose est un matériau utile pour la chromatographie car il n'absorbe pas les biomolécules de manière significative, possède de bonnes propriétés d'écoulement et peut tolérer des pH extrêmes et une force ionique ainsi qu'une concentration élevée de dénaturants tels que l' urée 8M ou la guanidine HCl 6M . Des exemples de matrice à base d'agarose pour la chromatographie par filtration sur gel sont Sepharose et WorkBeads 40 SEC (agarose perlée réticulée), Praesto et Superose (agaroses perlées hautement réticulées) et Superdex ( dextrane lié de manière covalente à l'agarose).
Pour la chromatographie d'affinité, l'agarose perlé est la résine matricielle la plus couramment utilisée pour la fixation des ligands qui se lient aux protéines. Les ligands sont liés de manière covalente par l'intermédiaire d'un espaceur à des groupes hydroxyle activés de polymère de billes d'agarose. Les protéines d'intérêt peuvent ensuite être sélectivement liées aux ligands pour les séparer des autres protéines, après quoi elles peuvent être éluées. Les billes d'agarose utilisées ont typiquement des densités de 4 % et 6 % avec une capacité de liaison élevée pour les protéines.
Milieux de culture solides
Une plaque d'agarose peut parfois être utilisée à la place de la gélose pour la culture d'organismes, car la gélose peut contenir des impuretés pouvant affecter la croissance de l'organisme ou certaines procédures en aval telles que la réaction en chaîne par polymérase (PCR). L'agarose est également plus dur que l'agar et peut donc être préférable lorsqu'une plus grande force de gel est nécessaire, et sa température de gélification plus basse peut empêcher de provoquer un choc thermique pour l'organisme lorsque les cellules sont mises en suspension dans un liquide avant la gélification. Il peut être utilisé pour la culture de bactéries autotrophes strictes, de protoplastes végétaux , de Caenorhabditis elegans , d'autres organismes et de diverses lignées cellulaires.
Culture cellulaire 3D
L'agarose est souvent utilisé comme support pour la culture tridimensionnelle de cellules humaines et animales . Parce que l'agarose forme un hydrogel non cytotoxique , il peut être utilisé pour reproduire l'environnement naturel des cellules du corps humain, la matrice extracellulaire . Cependant, l'agarose forme un hydrogel inerte rigide qui ne porte aucune information biologique, ainsi les cellules humaines et animales ne peuvent pas adhérer au polysaccharide . En raison de ces propriétés spécifiques, l' hydrogel d' agarose imite l'environnement naturel des cellules cartilagineuses et il a été démontré qu'il favorise la différenciation des chondrocytes en cartilage . Afin de modifier les propriétés mécaniques de l'agarose pour reproduire l'environnement naturel d'autres cellules humaines, l'agarose peut être modifié chimiquement par l'oxydation précise de l'alcool primaire du D- galactose en acide carboxylique . Cette modification chimique fournit une nouvelle classe de matériaux appelés agarose carboxylé. Grâce au contrôle du nombre de D-galactose carboxylé sur le squelette polysaccharidique , les propriétés mécaniques de l'hydrogel résultant peuvent être contrôlées avec précision. Ces hydrogels d'agarose carboxylés peuvent ensuite être liés de manière covalente à des peptides pour former un hydrogel sur lequel les cellules peuvent adhérer. Il a été démontré que ces hydrogels d'agarose carboxylés dirigent l'organisation des cellules endothéliales humaines dans des lumières polarisées. Le mélange d'agarose entièrement carboxylé avec de l'agarose naturel peut être utilisé pour fabriquer des hydrogels qui couvrent toute une gamme de propriétés mécaniques.
Essais de motilité
L'agarose est parfois utilisé à la place de la gélose pour mesurer la motilité et la mobilité des micro-organismes. Les espèces mobiles pourront migrer, quoique lentement, à travers le gel poreux et les taux d'infiltration pourront alors être visualisés. La porosité du gel est directement liée à la concentration de gélose ou d'agarose dans le milieu, de sorte que différentes concentrations de gels peuvent être utilisées pour évaluer la nage , l' essaimage , le glissement et la motilité d' une cellule . Un essai de migration cellulaire sous agarose peut être utilisé pour mesurer la chimiotaxie et la chimiokinésie. Une couche de gel d'agarose est placée entre une population cellulaire et un chimiotactique . Au fur et à mesure qu'un gradient de concentration se développe à partir de la diffusion de l'agent chimiotactique dans le gel, diverses populations cellulaires nécessitant différents niveaux de stimulation pour migrer peuvent ensuite être visualisées au fil du temps à l'aide de la microphotographie alors qu'elles creusent un tunnel vers le haut à travers le gel contre la gravité le long du gradient.