Spectroscopie de corrélation de fluorescence - Fluorescence correlation spectroscopy

La spectroscopie de corrélation de fluorescence ( FCS ) est une analyse statistique, par corrélation temporelle, des fluctuations stationnaires de l' intensité de fluorescence . Son fondement théorique est issu de l'hypothèse de régression de L. Onsager . L'analyse fournit des paramètres cinétiques des processus physiques sous-jacents aux fluctuations. L'une des applications intéressantes de ceci est l'analyse des fluctuations de concentration de particules fluorescentes (molécules) en solution. Dans cette application, la fluorescence émise à partir d'un espace très réduit en solution contenant un petit nombre de particules fluorescentes (molécules) est observée. L'intensité de fluorescence est fluctuante en raison du mouvement brownien des particules. En d'autres termes, le nombre de particules dans le sous-espace défini par le système optique change aléatoirement autour du nombre moyen. L'analyse donne le nombre moyen de particules fluorescentes et le temps de diffusion moyen, lorsque la particule traverse l'espace. Finalement, la concentration et la taille de la particule (molécule) sont déterminées. Les deux paramètres sont importants dans la recherche biochimique, la biophysique et la chimie.

Le FCS est un outil analytique si sensible car il observe un petit nombre de molécules (concentrations nanomolaires à picomolaires) dans un petit volume (~1μm ³ ). Contrairement à d'autres méthodes (telles que l' analyse HPLC ), le FCS n'a pas de processus de séparation physique ; au lieu de cela, il atteint sa résolution spatiale grâce à son optique. De plus, FCS permet l'observation de molécules marquées par fluorescence dans la voie biochimique dans des cellules vivantes intactes. Cela ouvre un nouveau domaine, la « biochimie in situ ou in vivo » : tracer la voie biochimique dans des cellules et organes intacts.

Communément, le FCS est employé dans le cadre de la microscopie optique , en particulier la microscopie confocale ou la microscopie à excitation biphotonique . Dans ces techniques, la lumière est focalisée sur un échantillon et les fluctuations d'intensité de fluorescence mesurées (dues à la diffusion , aux réactions physiques ou chimiques, à l'agrégation, etc.) sont analysées à l'aide de l'autocorrélation temporelle. Étant donné que la propriété mesurée est essentiellement liée à l'amplitude et/ou à la quantité de fluctuations, il existe un régime de mesure optimal au niveau où des espèces individuelles entrent ou sortent du volume d'observation (ou s'allument et s'éteignent dans le volume). Lorsque trop d'entités sont mesurées en même temps, les fluctuations globales sont faibles par rapport au signal total et peuvent ne pas être résolues - dans l'autre sens, si les événements de fluctuation individuels sont trop épars dans le temps, une mesure peut prendre trop de temps. longue. La FCS est en quelque sorte la contrepartie fluorescente de la diffusion dynamique de la lumière , qui utilise la diffusion cohérente de la lumière, au lieu de la fluorescence (incohérente).

Lorsqu'un modèle approprié est connu, FCS peut être utilisé pour obtenir des informations quantitatives telles que

• coefficients de diffusion
• rayons hydrodynamiques
• concentrations moyennes
• taux de réaction chimique cinétique
• dynamique singulet-triplet

Étant donné que les marqueurs fluorescents sont disponibles dans une variété de couleurs et peuvent être spécifiquement liés à une molécule particulière (par exemple, protéines, polymères, complexes métalliques, etc.), il est possible d'étudier le comportement de molécules individuelles (en succession rapide dans des solutions composites) . Avec le développement de détecteurs sensibles tels que les photodiodes à avalanche, la détection du signal de fluorescence provenant de molécules individuelles dans des échantillons très dilués est devenue pratique. Avec cela a émergé la possibilité de mener des expériences FCS dans une grande variété de spécimens, allant de la science des matériaux à la biologie. L'avènement des cellules modifiées avec des protéines génétiquement marquées (comme la protéine fluorescente verte ) a fait du FCS un outil commun pour étudier la dynamique moléculaire dans les cellules vivantes.

Histoire

Les techniques de corrélation de signaux ont été appliquées pour la première fois expérimentalement à la fluorescence en 1972 par Magde, Elson et Webb, qui sont donc communément considérés comme les « inventeurs » de FCS. La technique a été développée dans un groupe d'articles par ces auteurs et d'autres peu de temps après, établissant les fondements théoriques et les types d'applications. Vers 1990, avec la capacité de détecter un nombre suffisamment petit de particules de fluorescence, deux problèmes sont apparus : une distribution non gaussienne de l'intensité de fluorescence et le volume de mesure confocal tridimensionnel d'un système de microscopie laser. Le premier a conduit à une analyse des distributions et des moments des signaux fluorescents pour l'extraction d'informations moléculaires, qui est finalement devenue une collection de méthodes connues sous le nom d' analyses de luminosité . Voir Thompson (1991) pour une revue de cette période.

À partir de 1993, un certain nombre d'améliorations dans les techniques de mesure, notamment en utilisant la microscopie confocale, puis la microscopie à deux photons, pour mieux définir le volume de mesure et le bruit de fond de rejet, ont considérablement amélioré le rapport signal sur bruit et permis la sensibilité à une seule molécule. Depuis lors, il y a eu un regain d'intérêt pour le FCS et, en août 2007, plus de 3 000 articles utilisant le FCS ont été trouvés dans Web of Science. Voir Krichevsky et Bonnet pour une revue. En outre, il y a eu une vague d'activités étendant le FCS de diverses manières, par exemple à la microscopie confocale à balayage laser et à disque rotatif (à partir d'une mesure stationnaire à un seul point), en utilisant la corrélation croisée (FCCS) entre deux canaux fluorescents à la place d'autocorrélation et en utilisant le transfert d'énergie par résonance de Förster (FRET) au lieu de la fluorescence.

Configuration FCS typique

La configuration FCS typique consiste en une ligne laser (longueurs d'onde allant généralement de 405 à 633 nm ( cw ) et de 690 à 1100 nm (pulsé)), qui est réfléchie dans un objectif de microscope par un miroir dichroïque. Le faisceau laser est focalisé dans l'échantillon, qui contient des particules fluorescentes (molécules) à une dilution si élevée que seules quelques-unes se trouvent dans la tache focale (généralement 1 à 100 molécules dans un fL). Lorsque les particules traversent le volume focal, elles deviennent fluorescentes. Cette lumière est collectée par le même objectif et, du fait qu'elle est décalée vers le rouge par rapport à la lumière d'excitation, elle traverse le miroir dichroïque pour atteindre un détecteur, typiquement un tube photomultiplicateur , un détecteur à photodiode à avalanche ou un détecteur à photon unique à nanofil supraconducteur . Le signal électronique résultant peut être stocké soit directement sous forme de trace d'intensité en fonction du temps à analyser ultérieurement, soit calculé pour générer directement l' autocorrélation (ce qui nécessite des cartes d'acquisition spéciales). La courbe FCS à elle seule ne représente qu'un spectre temporel. Il faut en tirer des conclusions sur les phénomènes physiques avec des modèles appropriés. Les paramètres d'intérêt sont trouvés après ajustement de la courbe d'autocorrélation aux formes fonctionnelles modélisées.

Le volume de mesure

Le volume de mesure est une convolution de géométries d'illumination (excitation) et de détection, qui résultent des éléments optiques impliqués. Le volume résultant est décrit mathématiquement par la fonction d'étalement du point (ou PSF), il s'agit essentiellement de l'image d'une source ponctuelle. Le PSF est souvent décrit comme un ellipsoïde (avec des limites floues) de quelques centaines de nanomètres de diamètre focal et près d'un micromètre le long de l'axe optique. La forme varie considérablement (et a un impact important sur les courbes FCS résultantes) en fonction de la qualité des éléments optiques (il est crucial d'éviter l'astigmatisme et de vérifier la forme réelle de la PSF sur l'instrument). Dans le cas de la microscopie confocale, et pour les petits trous d'épingle (autour d'une unité d'Airy), la PSF est bien approchée par les Gaussiennes :

${\displaystyle PSF(r,z)=I_{0}e^{-2r^{2}/\omega _{xy}^{2}}e^{-2z^{2}/\omega _{z }^{2}}}$

où est l'intensité maximale, r et z sont les positions radiale et axiale, et et sont les rayons radial et axial, et . Cette forme gaussienne est supposée pour dériver la forme fonctionnelle de l'autocorrélation. ${\style d'affichage I_{0}}$${\displaystyle \omega _{xy}}$${\displaystyle \omega _{z}}$${\displaystyle \omega _{z}>\omega _{xy}}$

Il mesure généralement 200 à 300 nm et est 2 à 6 fois plus grand. Une façon courante de calibrer les paramètres de volume de mesure consiste à effectuer une FCS sur une espèce dont le coefficient de diffusion et la concentration sont connus (voir ci-dessous). Les coefficients de diffusion des fluorophores courants dans l'eau sont donnés dans une section ultérieure. ${\displaystyle \omega _{xy}}$${\displaystyle \omega _{z}}$

L'approximation gaussienne fonctionne à des degrés divers selon les détails optiques, et des corrections peuvent parfois être appliquées pour compenser les erreurs d'approximation.

Fonction d'autocorrélation

La fonction d'autocorrélation (temporelle) est la corrélation d'une série temporelle avec elle-même décalée dans le temps , en fonction de : ${\style d'affichage \tau }$${\style d'affichage \tau }$

${\displaystyle G(\tau )={\frac {\langle \delta I(t)\delta I(t+\tau )\rangle }{\langle I(t)\rangle ^{2}}}={\ frac {\langle I(t)I(t+\tau )\rangle }{\langle I(t)\rangle ^{2}}}-1}$

où est l'écart par rapport à l'intensité moyenne. La normalisation (dénominateur) est ici la plus couramment utilisée pour FCS, car alors la corrélation à , G (0), est liée au nombre moyen de particules dans le volume de mesure. ${\displaystyle \delta I(t)=I(t)-\langle I(t)\rangle }$${\style d'affichage \tau =0}$

À titre d'exemple, les données brutes de FCS et son autocorrélation pour diffuser librement la Rhodamine 6G sont présentées dans la figure de droite. Le graphique du haut montre l'intensité de la fluorescence en fonction du temps. L'intensité fluctue au fur et à mesure que la Rhodamine 6G entre et sort du volume focal. Dans le graphique du bas se trouve l'autocorrélation sur les mêmes données. Des informations sur le taux de diffusion et la concentration peuvent être obtenues en utilisant l'un des modèles décrits ci-dessous.

Pour un profil d'éclairement gaussien , la fonction d'autocorrélation est donnée par la formule maîtresse générale ${\style d'affichage PSF(r,z)}$

${\displaystyle G(\tau )={\frac {1}{\langle N\rangle }}\left\langle \exp \left(-{\frac {\Delta X(\tau )^{2}+\ Delta Y(\tau )^{2}}{w_{xy}^{2}}}-{\frac {\Delta Z(\tau )^{2}}{w_{z}^{2}}} \right)\right\rangle ,}$

où le vecteur désigne le déplacement stochastique dans l'espace d'un fluorophore après le temps . L'expression est valide si le nombre moyen de fluorophores dans le volume focal est faible et si les états sombres, etc., du fluorophore peuvent être ignorés. En particulier, aucune hypothèse n'a été faite sur le type de mouvement diffusif à l'étude. La formule permet une interprétation de (i) une probabilité de retour pour de petits paramètres de faisceau et (ii) la fonction génératrice de moment de if varient. ${\displaystyle \Delta {\vec {R}}(\tau )=(\Delta X(\tau ),\Delta Y(\tau ),\Delta Z(\tau ))}$${\style d'affichage \tau }$${\displaystyle \langle N\rangle }$${\style d'affichage G(\tau )}$${\style d'affichage w_{xy},w_{z}}$${\displaystyle |\Delta {\vec {R}}(\tau )|^{2}}$${\style d'affichage w_{xy},w_{z}}$

Interprétation de la fonction d'autocorrélation

Pour extraire des quantités d'intérêt, les données d'autocorrélation peuvent être ajustées, généralement à l'aide d'un algorithme des moindres carrés non linéaire . La forme fonctionnelle de l'ajustement dépend du type de dynamique (et de la géométrie optique considérée).

Diffusion normale

Les particules fluorescentes utilisées dans le FCS sont petites et subissent donc des mouvements thermiques en solution. L'expérience FCS la plus simple est donc la diffusion 3D normale, pour laquelle l'autocorrélation est :

${\displaystyle \ G(\tau )=G(0){\frac {1}{(1+(\tau /\tau _{D}))(1+a^{-2}(\tau /\ tau _{D}))^{1/2}}}+G(\infty )}$

où est le rapport des rayons axiaux sur radiaux du volume de mesure, et est le temps de séjour caractéristique. Cette forme a été dérivée en supposant un volume de mesure gaussien. Typiquement, l'ajustement aurait trois paramètres libres - G (0), , et - à partir desquels le coefficient de diffusion et la concentration en fluorophores peuvent être obtenus. ${\displaystyle a=\omega _{z}/\omega _{xy}}$${\displaystyle e^{-2}}$${\displaystyle \tau _{D}}$${\style d'affichage G(\infty )}$${\displaystyle \tau _{D}}$

Avec la normalisation utilisée dans la section précédente, G (0) donne le nombre moyen de diffuseurs dans le volume <N>, ou de manière équivalente - connaissant la taille du volume d'observation - la concentration moyenne :

${\displaystyle \ G(0)={\frac {1}{\langle N\rangle }}={\frac {1}{V_{\text{eff}}\langle C\rangle }},}$

où le volume effectif est obtenu en intégrant la forme gaussienne du volume de mesure et est donné par :

${\displaystyle \ V_{\text{eff}}=\pi ^{3/2}\omega _{xy}^{2}\omega _{z}.\,}$

D donne le coefficient de diffusion :

${\displaystyle \ D=\omega _{xy}^{2}/{4\tau _{D}}.}$

Diffusion anormale

Si les particules diffusantes sont gênées par des obstacles ou poussées par une force (moteurs moléculaires, écoulement, etc.), la dynamique n'est souvent pas suffisamment bien décrite par le modèle de diffusion normal, où le déplacement quadratique moyen (MSD) croît linéairement avec le temps. Au lieu de cela, la diffusion peut être mieux décrite comme une diffusion anormale , où la dépendance temporelle du MSD est non linéaire comme dans la loi de puissance :

${\displaystyle \ MSD=6D_{a}t^{\alpha }\,}$

où est un coefficient de diffusion anormal. La "diffusion anormale" se réfère généralement uniquement à ce modèle très générique, et non aux nombreuses autres possibilités qui pourraient être qualifiées d'anormales. De plus, une loi de puissance n'est, au sens strict, la forme attendue que pour une gamme étroite de systèmes rigoureusement définis, par exemple lorsque la distribution des obstacles est fractale . Néanmoins, une loi de puissance peut être une approximation utile pour un plus large éventail de systèmes. ${\style d'affichage D_{a}}$

La fonction d'autocorrélation FCS pour la diffusion anormale est :

${\displaystyle G(\tau )=G(0){\frac {1}{(1+(\tau /\tau _{D})^{\alpha })(1+a^{-2}( \tau /\tau _{D})^{\alpha })^{1/2}}}+G(\infty ),}$

où l'exposant anormal est le même que ci-dessus et devient un paramètre libre dans l'ajustement. ${\style d'affichage \alpha }$

En utilisant FCS, l'exposant anormal s'est avéré être une indication du degré d'encombrement moléculaire (il est inférieur à un et plus petit pour des degrés d'encombrement plus importants).

Diffusion polydispersée

S'il existe des particules diffusantes de tailles différentes (coefficients de diffusion), il est courant de s'adapter à une fonction qui est la somme des formes d'un seul composant :

${\displaystyle \ G(\tau )=G(0)\sum _{i}{\frac {\alpha _{i}}{(1+(\tau /\tau _{D,i}))( 1+a^{-2}(\tau /\tau _{D,i}))^{1/2}}}+G(\infty )}$

où la somme est sur le nombre de tailles différentes de particules, indexé par i, et donne la pondération, qui est liée au rendement quantique et à la concentration de chaque type. Cela introduit de nouveaux paramètres, ce qui rend l'ajustement plus difficile car un espace de dimension supérieure doit être recherché. L'ajustement des moindres carrés non linéaire devient généralement instable même avec un petit nombre de s. Un schéma d'ajustement plus robuste, particulièrement utile pour les échantillons polydispersés, est la méthode d'entropie maximale. ${\displaystyle \alpha _{i}}$${\displaystyle \tau _{D,i}}$

Diffusion avec flux

Avec diffusion et écoulement uniforme avec vitesse dans la direction latérale, l'autocorrélation est : ${\style d'affichage v}$

${\displaystyle \ G(\tau )=G(0){\frac {1}{(1+(\tau /\tau _{D}))(1+a^{-2}(\tau /\ tau _{D}))^{1/2}}}\times \exp[-(\tau /\tau _{v})^{2}\times {\frac {1}{1+\tau / \tau _{D}}}]+G(\infty )}$

où est le temps de séjour moyen s'il n'y a qu'un écoulement (pas de diffusion). ${\displaystyle \tau _{v}=\omega _{xy}/v}$

Relaxation chimique

Un large éventail d'expériences FCS possibles impliquent des réactions chimiques qui fluctuent continuellement par rapport à l'équilibre en raison de mouvements thermiques (puis "détendent"). Contrairement à la diffusion, qui est également un processus de relaxation, les fluctuations provoquent des changements entre des états d'énergies différentes. Un système très simple montrant une relaxation chimique serait un site de liaison stationnaire dans le volume de mesure, où les particules ne produisent de signal que lorsqu'elles sont liées (par exemple par FRET, ou si le temps de diffusion est beaucoup plus rapide que l'intervalle d'échantillonnage). Dans ce cas, l'autocorrélation est :

${\displaystyle \ G(\tau )=G(0)\exp(-\tau /\tau _{B})+G(\infty )}$

où

${\displaystyle \ \tau _{B}=(k_{\text{on}}+k_{\text{off}})^{-1}}$

est le temps de relaxation et dépend de la cinétique de la réaction (vitesses d'activation et de désactivation), et :

${\displaystyle G(0)={\frac {1}{\langle N\rangle }}{\frac {k_{on}}{k_{off}}}={\frac {1}{\langle N\ rang }}K}$

est liée à la constante d'équilibre K .

La plupart des systèmes avec relaxation chimique présentent également une diffusion mesurable, et la fonction d'autocorrélation dépendra des détails du système. Si la diffusion et la réaction chimique sont découplées, l'autocorrélation combinée est le produit des autocorrélations chimique et diffusive.

Correction de l'état du triplet

Les autocorrélations ci-dessus supposent que les fluctuations ne sont pas dues à des changements dans les propriétés fluorescentes des particules. Cependant, pour la majorité des fluorophores (bio)organiques, par exemple les colorants fluorescents verts , la rhodamine, Cy3 et Alexa Fluor, une partie des particules illuminées est excitée jusqu'à un état triplet (ou d'autres états de décomposition non radiatifs) et n'émet alors pas photons pour un temps de relaxation caractéristique . Est généralement de l'ordre de la microseconde, ce qui est généralement plus petit que la dynamique d'intérêt (par exemple ) mais suffisamment grand pour être mesuré. Un terme multiplicatif est ajouté à l'autocorrélation pour tenir compte de l'état triplet. Pour une diffusion normale : ${\displaystyle \tau _{F}}$${\displaystyle \tau _{F}}$${\displaystyle \tau _{D}}$

${\displaystyle \ G(\tau )=G(0){\frac {(1-F+Fe^{-\tau /\tau _{F}})}{(1-F)}}{\frac {1}{(1+(\tau /\tau _{D,i}))(1+a^{-2}(\tau /\tau _{D,i}))^{1/2} }}+G(\infty )}$

où est la fraction de particules qui sont entrées dans l'état triplet et est le temps de relaxation correspondant à l'état triplet. Si la dynamique d'intérêt est beaucoup plus lente que la relaxation de l'état triplet, la composante à court terme de l'autocorrélation peut simplement être tronquée et le terme triplet est inutile. ${\style d'affichage \ F}$${\displaystyle \ \tau _{F}}$

Sondes fluorescentes courantes

L'espèce fluorescente utilisée dans FCS est généralement une biomolécule d'intérêt qui a été marquée avec un fluorophore (en utilisant l' immunohistochimie par exemple), ou est un fluorophore nu qui est utilisé pour sonder un environnement d'intérêt (par exemple le cytosquelette d'une cellule). Le tableau suivant donne les coefficients de diffusion de certains fluorophores courants dans l'eau à température ambiante, et leurs longueurs d'onde d'excitation.

Un colorant fluorescent	${\style d'affichage \ D}$ [10 -10 m 2 s -1 ]	T [°C]	Longueur d' onde d' excitation [nm]	Référence
Rhodamine 6G	2,8, 3,0, 4,14 ± 0,05, 4,20 ± 0,06	25	514
Rhodamine 110	2.7		488
Tétraméthyl rhodamine	2.6		543
Cy3	2.8		543
Cy5	2,5, 3,7 ± 0,15	25	633
carboxyfluorescéine	3.2		488
Alexa 488	1,96, 4,35	22,5±0,5	488
Atto 655-maléimide	4,07 ± 0,1	25	663
Atto 655-acide carboxylique	4,26 ± 0,08	25	663
2′, 7′-difluorofluorescéine (Oregon Green 488)	4,11 ± 0,06	25	498

Variantes de FCS

FCS se réfère presque toujours à la mesure d'autocorrélation temporelle à un seul point, à un seul canal, bien que le terme « spectroscopie de corrélation de fluorescence » hors de son contexte scientifique historique n'implique aucune restriction de ce type. FCS a été étendu dans un certain nombre de variantes par différents chercheurs, chaque extension générant un autre nom (généralement un acronyme).

Spectroscopie de corrélation de fluorescence à variation ponctuelle (svFCS)

Alors que FCS est une mesure ponctuelle fournissant un temps de diffusion à un volume d'observation donné, svFCS est une technique où le spot d'observation est modifié afin de mesurer les temps de diffusion à différentes tailles de spot. La relation entre le temps de diffusion et la surface du spot est linéaire et pourrait être tracée afin de décrypter la contribution majeure du confinement. La courbe résultante est appelée loi de diffusion. Cette technique est utilisée en biologie pour étudier l'organisation de la membrane plasmique sur les cellules vivantes.

${\displaystyle \ \omega _{xy}^{2}=4D\tau _{D}+t_{0}}$

où est l'intersection de l'axe y. En cas de diffusion brownienne, . En cas de confinement dû à des domaines isolés, alors qu'en cas de domaines isolés, . ${\style d'affichage t_{0}}$${\style d'affichage t_{0}=0}$${\style d'affichage t_{0}>0}$${\style d'affichage t_{0}<0}$

Études svFCS sur les cellules vivantes et papiers de simulation

Spectroscopie de corrélation de fluorescence contrôlée par le volume d'échantillonnage (SVC-FCS) :

FCS z-scan

FCS avec Nano-ouvertures : briser la barrière de diffraction

STED-FCS :

Spectroscopie de corrélation croisée par fluorescence ( FCCS )

FCS est parfois utilisé pour étudier les interactions moléculaires en utilisant des différences de temps de diffusion (par exemple, le produit d'une réaction d'association sera plus grand et aura donc des temps de diffusion plus longs que les réactifs pris individuellement); Cependant, le FCS est relativement insensible à la masse moléculaire, comme le montre l'équation suivante reliant la masse moléculaire au temps de diffusion des particules globulaires (par exemple des protéines) :

${\displaystyle \ \tau _{D}={\frac {3\pi \omega _{xy}^{2}\eta }{2kT}}(M)^{1/3}}$

où est la viscosité de l'échantillon et est la masse moléculaire de l'espèce fluorescente. En pratique, les temps de diffusion doivent être suffisamment différents - un facteur d'au moins 1,6 - ce qui signifie que les masses moléculaires doivent différer d'un facteur 4. La spectroscopie de corrélation croisée à fluorescence bicolore (FCCS) mesure les interactions en corrélant deux ou plus de canaux fluorescents (un canal pour chaque réactif), ce qui distingue les interactions de manière plus sensible que le FCS, en particulier lorsque le changement de masse dans la réaction est faible. ${\style d'affichage \ \eta }$${\style d'affichage \ M}$

Méthodes d'analyse de la luminosité

Cet ensemble de méthodes comprend le nombre et la luminosité (N&B), l'histogramme de comptage de photons (PCH), l'analyse de distribution d'intensité de fluorescence (FIDA) et l'analyse de cumul. et analyse de la distribution de l'intensité spatiale. La combinaison de plusieurs méthodes est également signalée. La spectroscopie de corrélation croisée de fluorescence surmonte la faible dépendance du taux de diffusion sur la masse moléculaire en examinant la coïncidence multicolore. Et les homo-interactions ? La solution réside dans l'analyse de la luminosité. Ces méthodes utilisent l'hétérogénéité de la distribution d'intensité de la fluorescence pour mesurer la luminosité moléculaire de différentes espèces dans un échantillon. Étant donné que les dimères contiendront deux fois plus de marqueurs fluorescents que les monomères, leur luminosité moléculaire sera approximativement le double de celle des monomères. En conséquence, la luminosité relative est sensible à une mesure d'oligomérisation. La luminosité moléculaire moyenne ( ) est liée à la variance ( ) et à l'intensité moyenne ( ) comme suit : ${\displaystyle \langle \epsilon \rangle }$${\displaystyle \sigma ^{2}}$${\displaystyle \langle I\rangle }$

${\displaystyle \ \langle \varepsilon \rangle ={\frac {\sigma ^{2}-\langle I\rangle }{\langle I\rangle }}=\sum _{i}f_{i}\varepsilon _ {je}}$

Voici et sont respectivement l'intensité fractionnaire et la luminosité moléculaire des espèces . ${\displaystyle f_{i}}$${\displaystyle \epsilon _{i}}$${\style d'affichage i}$

FRET-FCS

Une autre approche basée sur le FCS pour étudier les interactions moléculaires utilise le transfert d'énergie par résonance de fluorescence (FRET) au lieu de la fluorescence, et s'appelle FRET-FCS. Avec FRET, il existe deux types de sondes, comme avec FCCS ; cependant, il n'y a qu'un seul canal et la lumière n'est détectée que lorsque les deux sondes sont très proches, suffisamment proches pour assurer une interaction. Le signal FRET est plus faible qu'avec la fluorescence, mais présente l'avantage qu'il n'y a de signal qu'au cours d'une réaction (à part l' autofluorescence ).

Numérisation FCS

Dans la spectroscopie de corrélation de fluorescence à balayage (sFCS), le volume de mesure est déplacé à travers l'échantillon d'une manière définie. L'introduction du balayage est motivée par sa capacité à atténuer ou à éliminer plusieurs problèmes distincts souvent rencontrés dans les FCS standard, et ainsi, à étendre la gamme d'applicabilité des méthodes de corrélation de fluorescence dans les systèmes biologiques.

Certaines variantes de FCS ne s'appliquent qu'aux microscopes laser à balayage série. La spectroscopie de corrélation d'images et ses variations ont toutes été mises en œuvre sur un microscope confocal à balayage ou à balayage à deux photons, mais transférées à d'autres microscopes, comme un microscope confocal à disque rotatif. Le Raster ICS (RICS) et le FCS sensible à la position (PSFCS) intègrent le délai entre les parties du balayage d'image dans l'analyse. De plus, les balayages de faible dimension (par exemple, un anneau circulaire)—uniquement possibles sur un système de balayage—peuvent accéder à des échelles de temps entre les mesures d'un seul point et les mesures d'image complète. Le chemin de balayage a également été conçu pour suivre de manière adaptative les particules.

Disque tournant FCS et cartographie spatiale

N'importe laquelle des méthodes de spectroscopie de corrélation d'images peut également être effectuée sur un microscope confocal à disque rotatif, qui en pratique peut obtenir des vitesses d'imagerie plus rapides par rapport à un microscope confocal à balayage laser. Cette approche a récemment été appliquée à la diffusion dans un environnement complexe variant dans l'espace, produisant une carte de résolution de pixels d'un coefficient de diffusion. La cartographie spatiale de la diffusion avec FCS a ensuite été étendue au système TIRF. La cartographie spatiale de la dynamique utilisant des techniques de corrélation avait été appliquée auparavant, mais seulement à des points clairsemés ou à une résolution grossière.

Spectroscopie de corrélation d'images (ICS)

Lorsque le mouvement est lent (en biologie, par exemple, diffusion dans une membrane), obtenir des statistiques adéquates à partir d'une expérience FCS en un seul point peut prendre un temps prohibitif. Plus de données peuvent être obtenues en réalisant l'expérience dans plusieurs points spatiaux en parallèle, à l'aide d'un microscope confocal à balayage laser. Cette approche a été appelée spectroscopie de corrélation d'images (ICS). Les mesures peuvent ensuite être moyennées ensemble.

Une autre variante de l'ICS effectue une autocorrélation spatiale sur les images, ce qui donne des informations sur la concentration des particules. La corrélation est ensuite moyennée dans le temps. Bien que le bruit blanc de la caméra ne s'autocorréle pas dans le temps, il le fait dans l'espace - cela crée une amplitude de bruit blanc dans la fonction d'autocorrélation spatiale qui doit être prise en compte lors de l'ajustement de l'amplitude d'autocorrélation afin de trouver la concentration de molécules fluorescentes.

Une extension naturelle des versions de corrélation temporelle et spatiale est l'ICS spatio-temporelle (STICS). Dans STICS il n'y a pas de moyennage explicite dans l'espace ou dans le temps (seulement le moyennage inhérent à la corrélation). Dans les systèmes à mouvement non isotrope (par exemple flux dirigé, diffusion asymétrique), STICS peut extraire l'information directionnelle. Une variante étroitement liée à STICS (par la transformée de Fourier) est la spectroscopie de corrélation d'images dans l'espace k (kICS).

Il existe également des versions de corrélation croisée de l'ICS, qui peuvent donner la concentration, la distribution et la dynamique des molécules fluorescentes colocalisées. Les molécules sont considérées comme co-localisées lorsque les contributions individuelles de fluorescence sont indiscernables en raison du chevauchement des fonctions d'étalement des points des intensités de fluorescence.

Spectroscopie de corrélation d'images de particules (PICS)

PICS est un outil d'analyse puissant qui résout les corrélations sur la longueur du nanomètre et l'échelle de temps de la milliseconde. Adapté des méthodes de spectroscopie de corrélation d'images spatio-temporelles, il exploite la haute précision de positionnement du suivi de particule unique. Alors que les méthodes de suivi conventionnelles se décomposent si plusieurs trajectoires de particules se croisent, cette méthode fonctionne en principe pour des densités de molécules arbitrairement grandes et des paramètres dynamiques (par exemple, coefficients de diffusion, vitesses) tant que les molécules individuelles peuvent être identifiées. Il est informatiquement bon marché et robuste et permet d'identifier et de quantifier les mouvements (par exemple la diffusion, le transport actif, la diffusion confinée) au sein d'un ensemble de particules, sans aucune connaissance a priori de la dynamique.

Une extension de spectroscopie de corrélation croisée d'images de particules (PICCS) est disponible pour les processus biologiques impliquant plusieurs partenaires d'interaction, comme cela peut être observé par microscopie bicolore.

Imagerie de fluctuation optique à super résolution FCS (fcsSOFI)

L'imagerie de fluctuation optique à super-résolution (SOFI) est une technique de super-résolution qui atteint des résolutions spatiales inférieures à la limite de diffraction par une analyse de post-traitement avec des équations de corrélation, similaires à FCS. Alors que les rapports originaux de SOFI utilisaient des fluctuations du clignotement stationnaire des fluorophores, FCS a été combiné avec SOFI où les fluctuations sont produites à partir de sondes diffusantes pour produire des cartes spatiales de super-résolution des coefficients de diffusion. Cela a été appliqué pour comprendre la diffusion et les propriétés spatiales des matériaux poreux et confinés. Cela inclut l'agarose et les hydrogels PNIPAM sensibles à la température, les cristaux liquides et les polymères à phases séparées et les condensats d'ARN/protéines.

Réflexion interne totale FCS

La fluorescence par réflexion interne totale (TIRF) est une approche de microscopie qui n'est sensible qu'à une couche mince près de la surface d'une lamelle, ce qui minimise considérablement la fluorescence de fond. Le FCS a été étendu à ce type de microscope et s'appelle TIR-FCS. Parce que l'intensité de fluorescence dans TIRF diminue de façon exponentielle avec la distance de la lamelle (au lieu d'une gaussienne avec un confocal), la fonction d'autocorrélation est différente.

Imagerie FCS utilisant la microscopie à fluorescence à feuille de lumière

La microscopie à fluorescence à nappe lumineuse ou la microscopie à imagerie plane sélective (SPIM) utilise un éclairage qui se fait perpendiculairement à la direction d'observation, en utilisant une fine feuille de lumière (laser). Sous certaines conditions, ce principe d'éclairage peut être combiné avec la spectroscopie de corrélation de fluorescence, pour permettre une imagerie résolue spatialement de la mobilité et des interactions de particules fluorescentes telles que les protéines marquées GFP à l'intérieur d'échantillons biologiques vivants.

Autres approches dynamiques fluorescentes

Il existe deux principales alternatives de non-corrélation au FCS qui sont largement utilisées pour étudier la dynamique des espèces fluorescentes.

Récupération de fluorescence après photoblanchiment (FRAP)

Dans FRAP , une région est brièvement exposée à une lumière intense, photoblanchie irrémédiablement des fluorophores, et la récupération de fluorescence due à la diffusion de fluorophores proches (non blanchis) est imagée. L'un des principaux avantages du FRAP par rapport au FCS est la facilité d'interprétation des expériences qualitatives courantes en biologie cellulaire. Les différences entre les lignées cellulaires, ou les régions d'une cellule, ou avant et après l'application du médicament, peuvent souvent être caractérisées par une simple inspection des films. Les expériences FCS nécessitent un niveau de traitement et sont plus sensibles aux influences potentiellement confusionnelles telles que : diffusion rotationnelle, vibrations, photoblanchiment, dépendance à l'éclairage et à la couleur de fluorescence, statistiques inadéquates, etc. Il est beaucoup plus facile de modifier le volume de mesure dans FRAP, ce qui permet un plus grand contrôle. En pratique, les volumes sont généralement plus importants que dans FCS. Alors que les expériences FRAP sont généralement plus qualitatives, certains chercheurs étudient FRAP quantitativement et incluent la dynamique de liaison. Un inconvénient du FRAP en biologie cellulaire est la perturbation des radicaux libres de la cellule causée par le photoblanchiment. Il est également moins polyvalent, car il ne peut pas mesurer la concentration ou la diffusion rotationnelle, ou la co-localisation. FRAP nécessite une concentration significativement plus élevée de fluorophores que FCS.

Suivi des particules

Dans le suivi des particules, les trajectoires d'un ensemble de particules sont mesurées, généralement en appliquant des algorithmes de suivi des particules aux films. [1] Le suivi des particules a l'avantage que toutes les informations dynamiques sont conservées dans la mesure, contrairement au FCS où la corrélation fait la moyenne de la dynamique sur une seule courbe lisse. L'avantage est évident dans les systèmes montrant une diffusion complexe, où le calcul direct du déplacement quadratique moyen permet une comparaison directe avec la diffusion normale ou en loi de puissance. Pour appliquer le suivi des particules, les particules doivent être distinguables et donc à une concentration inférieure à celle requise du FCS. De plus, le suivi des particules est plus sensible au bruit, ce qui peut parfois affecter les résultats de manière imprévisible.

Excitation FCS à deux et trois photons

Plusieurs avantages à la fois en termes de résolution spatiale et de minimisation des dommages photo/photoblanchiment dans les échantillons organiques et/ou biologiques sont obtenus par une excitation à deux ou trois photons FCS.

Voir également

• Microscopie confocale
• Spectroscopie de corrélation croisée par fluorescence (FCCS)
• Transfert d'énergie de résonance de Förster (FRET)
• Diffusion de lumière dynamique
• Coefficient de diffusion

Les références

Lectures complémentaires

• Rigler R. et Widengren J. (1990). Détection ultrasensible de molécules uniques par spectroscopie de corrélation de fluorescence, BioScience (Ed. Klinge & Owman) p. 180
• Oehlenschläger, F.; Schwille, P.; Eigen, M. (1996). "Détection de l'ARN du VIH-1 par amplification basée sur la séquence d'acides nucléiques combinée à la spectroscopie de corrélation de fluorescence" . Proc. Natl. Acad. Sci. États-Unis . 93 (23): 12811-12816. Bibcode : 1996PNAS ... 9312811O . doi : 10.1073/pnas.93.23.12811 . PMC  24002 . PMID  8917501 .

Liens externes

• Hausstein, Elke ; Schwille, Petra (2004). "Méthodes spectroscopiques à molécule unique". Opinion actuelle en biologie structurale . 14 (5) : 531-540. doi : 10.1016/j.sbi.2004.09.04 . hdl : 11858/00-001M-0000-0029-D76C-C . PMID  15465312 .
• Salle de classe FCS
• Tutoriel FCS du Stowers Institute
• Tutoriel FCS du Consortium sur la migration cellulaire
• Spectroscopie de corrélation de fluorescence (FCS) (Becker & Hickl GmbH, page Web)