Projection à haut contenu - High-content screening

Le criblage à haut contenu (HCS), également connu sous le nom d' analyse à haut contenu (HCA) ou cellomique , est une méthode utilisée dans la recherche biologique et la découverte de médicaments pour identifier des substances telles que de petites molécules , des peptides ou des ARNi qui modifient le phénotype de une cellule de la manière souhaitée. Par conséquent, le criblage à haut contenu est un type de criblage phénotypique effectué dans des cellules impliquant l'analyse de cellules entières ou de composants de cellules avec lecture simultanée de plusieurs paramètres. Le HCS est lié au criblage à haut débit (HTS), dans lequel des milliers de composés sont testés en parallèle pour leur activité dans un ou plusieurs tests biologiques, mais implique des tests de phénotypes cellulaires plus complexes en tant que résultats. Les modifications phénotypiques peuvent inclure des augmentations ou des diminutions de la production de produits cellulaires tels que des protéines et/ou des modifications de la morphologie (aspect visuel) de la cellule. Par conséquent, l'AHC implique généralement une microscopie et une analyse d'image automatisées. Contrairement à l'analyse à haut contenu, le criblage à haut contenu implique un niveau de débit, c'est pourquoi le terme « criblage » différencie le HCS du HCA, qui peut être riche en contenu mais faible en débit.

Dans le criblage à haute teneur, les cellules sont d'abord incubées avec la substance et après un certain temps, les structures et les composants moléculaires des cellules sont analysés. L'analyse la plus courante consiste à marquer les protéines avec des marqueurs fluorescents , et enfin les changements dans le phénotype cellulaire sont mesurés à l'aide d'une analyse d'image automatisée . Grâce à l'utilisation de marqueurs fluorescents avec différents maxima d'absorption et d'émission, il est possible de mesurer plusieurs composants cellulaires différents en parallèle. De plus, l'imagerie est capable de détecter des changements à un niveau subcellulaire (par exemple, cytoplasme vs noyau vs autres organites ). Par conséquent, un grand nombre de points de données peuvent être collectés par cellule. En plus du marquage fluorescent, divers tests sans marqueur ont été utilisés dans le criblage à haute teneur.

Principes généraux

Une des applications du HCS est la découverte de nouveaux candidats médicaments

Le criblage à haut contenu (HCS) dans les systèmes cellulaires utilise des cellules vivantes comme outils de recherche biologique pour élucider le fonctionnement des cellules normales et malades. Le HCS est également utilisé pour découvrir et optimiser de nouveaux candidats médicaments. Le criblage à haut contenu est une combinaison de la biologie cellulaire moderne , avec tous ses outils moléculaires, avec la microscopie automatisée à haute résolution et la manipulation robotique. Les cellules sont d'abord exposées à des produits chimiques ou à des réactifs ARNi . Les modifications de la morphologie cellulaire sont ensuite détectées par analyse d'images . Les changements dans les quantités de protéines synthétisées par les cellules sont mesurés en utilisant une variété de techniques telles que les protéines fluorescentes vertes fusionnées à des protéines endogènes, ou par des anticorps fluorescents .

La technologie peut être utilisée pour déterminer si un médicament potentiel modifie la maladie. Par exemple, chez l'homme, les récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) sont une grande famille d'environ 880 protéines de surface cellulaire qui traduisent les changements extracellulaires de l'environnement en une réponse cellulaire, comme le déclenchement d'une augmentation de la pression artérielle en raison de la libération d'un hormone régulatrice dans la circulation sanguine. L'activation de ces GPCR peut impliquer leur entrée dans les cellules et lorsque cela peut être visualisé, cela peut être la base d'une analyse systématique de la fonction des récepteurs par génétique chimique , criblage systématique à l' échelle du génome ou manipulation physiologique.

Au niveau cellulaire, l'acquisition parallèle de données sur différentes propriétés cellulaires, par exemple l'activité des cascades de transduction du signal et l' intégrité du cytosquelette, est le principal avantage de cette méthode par rapport au criblage à haut débit plus rapide mais moins détaillé . Alors que le HCS est plus lent, la richesse des données acquises permet une compréhension plus approfondie des effets des médicaments.

Le criblage automatisé basé sur l'image permet l'identification de petits composés modifiant les phénotypes cellulaires et présente un intérêt pour la découverte de nouveaux produits pharmaceutiques et de nouveaux outils biologiques cellulaires pour modifier la fonction cellulaire. La sélection de molécules basée sur un phénotype cellulaire ne nécessite pas de connaissance préalable des cibles biochimiques affectées par les composés. Cependant, l'identification de la cible biologique facilitera considérablement l'optimisation préclinique et le développement clinique ultérieurs du composé touché. Compte tenu de l'utilisation croissante du criblage phénotypique/visuel en tant qu'outil biologique cellulaire, des méthodes sont nécessaires pour permettre l'identification systématique de cibles biochimiques si ces molécules doivent être largement utilisées. L'identification de la cible a été définie comme l'étape limitant la vitesse dans la génétique chimique/le criblage à haute teneur.

Instrumentation

Un lecteur d'images confocal automatisé

La technologie de criblage à haut contenu est principalement basée sur la microscopie numérique automatisée et la cytométrie en flux , en combinaison avec des systèmes informatiques pour l'analyse et le stockage des données. La technologie de « haut contenu » ou de biologie visuelle a deux objectifs, d'abord pour acquérir des informations résolues spatialement ou temporellement sur un événement et deuxièmement pour le quantifier automatiquement. Les instruments à résolution spatiale sont généralement des microscopes automatisés , et la résolution temporelle nécessite toujours une certaine forme de mesure de fluorescence dans la plupart des cas. Cela signifie que de nombreux instruments HCS sont des microscopes (à fluorescence ) qui sont connectés à une certaine forme de progiciel d'analyse d'images. Ceux-ci prennent en charge toutes les étapes de la prise d'images fluorescentes de cellules et fournissent une évaluation rapide, automatisée et impartiale des expériences.

Les instruments HCS sur le marché aujourd'hui peuvent être séparés en fonction d'un éventail de spécifications qui influencent considérablement la polyvalence des instruments et leur coût global. Ceux-ci incluent la vitesse, une chambre de cellules vivantes qui comprend le contrôle de la température et du CO2 (certains ont également un contrôle de l'humidité pour l'imagerie des cellules vivantes à plus long terme), une pipette ou un injecteur intégré pour des tests cinétiques rapides et des modes d'imagerie supplémentaires tels que confocal, champ clair, contraste de phase et FRET. L'une des différences les plus marquantes est de savoir si les instruments sont optiques confocaux ou non. La microscopie confocale se résume à l'imagerie/résolution d'une fine tranche à travers un objet et au rejet de la lumière floue provenant de l'extérieur de cette tranche. L'imagerie confocale permet un rapport d'image sur bruit plus élevé et une résolution plus élevée que la microscopie à épifluorescence plus couramment appliquée . Selon l'instrument, la confocalité est obtenue par balayage laser, un seul disque rotatif avec des trous d'épingle ou des fentes, un double disque rotatif ou une fente virtuelle. Il existe des compromis de sensibilité, de résolution, de vitesse, de phototoxicité, de photo-blanchiment, de complexité de l'instrument et de prix entre ces diverses techniques confocales.

Ce que tous les instruments partagent, c'est la capacité de prendre, de stocker et d'interpréter des images automatiquement et de s'intégrer dans de grandes plates-formes de manipulation de cellules/moyens robotiques.

Logiciel

De nombreux écrans sont analysés à l'aide du logiciel d'analyse d'images qui accompagne l'instrument, offrant une solution clé en main. Des alternatives logicielles tierces sont souvent utilisées pour des écrans particulièrement difficiles ou lorsqu'un laboratoire ou une installation dispose de plusieurs instruments et souhaite se standardiser sur une seule plate-forme d'analyse. Certains logiciels d'instruments permettent l'importation et l'exportation en masse d'images et de données, pour les utilisateurs qui souhaitent effectuer une telle normalisation sur une seule plate-forme d'analyse sans utiliser de logiciel tiers, cependant.

Applications

Cette technologie permet de réaliser un (très) grand nombre d'expériences, permettant un criblage exploratoire. Les systèmes cellulaires sont principalement utilisés en génétique chimique où de grandes collections diverses de petites molécules sont systématiquement testées pour leur effet sur les systèmes de modèles cellulaires. De nouveaux médicaments peuvent être trouvés en utilisant des criblages de dizaines de milliers de molécules, et ceux-ci sont prometteurs pour l'avenir du développement de médicaments. Au-delà de la découverte de médicaments, la génétique chimique vise à fonctionnaliser le génome en identifiant de petites molécules qui agissent sur la plupart des 21 000 produits géniques d'une cellule. Une technologie à haut contenu fera partie de cet effort qui pourrait fournir des outils utiles pour apprendre où et quand les protéines agissent en les assommant chimiquement. Cela serait très utile pour les gènes où les souris knock-out (un ou plusieurs gènes manquants) ne peuvent pas être produites car la protéine est nécessaire au développement, à la croissance ou est mortelle lorsqu'elle n'est pas là. Le knock-out chimique pourrait déterminer comment et où ces gènes fonctionnent. De plus, la technologie est utilisée en combinaison avec l' ARNi pour identifier des ensembles de gènes impliqués dans des mécanismes spécifiques, par exemple la division cellulaire. Ici, des bibliothèques d'ARN, couvrant tout un ensemble de gènes prédits à l'intérieur du génome de l'organisme cible, peuvent être utilisées pour identifier des sous-ensembles pertinents, facilitant l'annotation de gènes pour lesquels aucun rôle clair n'a été établi au préalable. Les grands ensembles de données produits par la biologie cellulaire automatisée contiennent des données quantitatives résolues spatialement qui peuvent être utilisées pour créer des modèles au niveau des systèmes et des simulations du fonctionnement des cellules et des organismes. Les modèles de biologie systémique de la fonction cellulaire permettraient de prédire pourquoi, où et comment la cellule réagit aux changements externes, à la croissance et à la maladie.

Histoire

La technologie de criblage à haut contenu permet l'évaluation de multiples paramètres biochimiques et morphologiques dans des systèmes biologiques intacts.

Pour les approches basées sur les cellules, l'utilité de la biologie cellulaire automatisée nécessite un examen de la façon dont l'automatisation et la mesure objective peuvent améliorer l'expérimentation et la compréhension de la maladie. Premièrement, il supprime l'influence de l'investigateur dans la plupart des aspects de la recherche en biologie cellulaire, mais pas tous, et deuxièmement, il rend possible des approches entièrement nouvelles.

En résumé, la biologie cellulaire classique du 20e siècle utilisait des lignées cellulaires cultivées en culture où les expériences étaient mesurées en utilisant des méthodes très similaires à celles décrites ici, mais là, l'investigateur a fait le choix de ce qui était mesuré et comment. Au début des années 1990, le développement des CCD caméras ( dispositif à couplage de charge caméras ) pour la recherche a créé l'occasion de mesurer les caractéristiques en images de cells- telles que la quantité de protéines est dans le noyau, combien est à l' extérieur. Des mesures sophistiquées ont rapidement suivi en utilisant de nouvelles molécules fluorescentes, qui sont utilisées pour mesurer les propriétés cellulaires comme les concentrations de second messager ou le pH des compartiments cellulaires internes. La large utilisation de la protéine fluorescente verte, une molécule de protéine fluorescente naturelle de méduse, a ensuite accéléré la tendance à l'imagerie cellulaire en tant que technologie dominante en biologie cellulaire. Malgré ces avancées, le choix de la cellule à imager, des données à présenter et de la manière de les analyser était encore choisi par l'investigateur.

Par analogie, si l'on imagine un terrain de football et des assiettes posées dessus, au lieu de les regarder tous, l'enquêteur en choisirait une poignée près de la ligne de score et devait laisser le reste. Dans cette analogie, le champ est une boîte de culture tissulaire, les plaques sur lesquelles poussent les cellules. Bien qu'il s'agisse d'une approche raisonnable et pragmatique, l'automatisation de l'ensemble du processus et de l'analyse permet l'analyse de l'ensemble de la population de cellules vivantes, de sorte que l'ensemble du terrain de football peut être mesuré.

Voir également

Les références

Lectures complémentaires

Liens externes