Organoïde - Organoid

Organoïde intestinal cultivé à partir de cellules souches Lgr5+.

Un organoïde est une version miniaturisée et simplifiée d'un organe produit in vitro en trois dimensions qui montre une micro-anatomie réaliste. Elles sont issues d'une ou de quelques cellules d'un tissu , cellules souches embryonnaires ou cellules souches pluripotentes induites , qui peuvent s'auto-organiser en culture tridimensionnelle grâce à leurs capacités d' auto-renouvellement et de différenciation . La technique de culture des organoïdes s'est rapidement améliorée depuis le début des années 2010, et elle a été désignée par The Scientist comme l'une des plus grandes avancées scientifiques de 2013. Les organoïdes sont utilisés par les scientifiques pour étudier les maladies et les traitements en laboratoire .

Histoire

Les tentatives de création d' organes in vitro ont commencé avec l'une des premières expériences de dissociation-réagrégation où Henry Van Peters Wilson a démontré que les cellules spongieuses dissociées mécaniquement peuvent se réagréger et s'auto-organiser pour générer un organisme entier. Au cours des décennies suivantes, plusieurs laboratoires ont pu générer différents types d'organes in vitro grâce à la dissociation et à la réagrégation de tissus organiques obtenus à partir d'amphibiens et de poussins embryonnaires. Les phénomènes de cellules dissociées mécaniquement s'agrégeant et se réorganisant pour reformer le tissu à partir duquel elles ont été obtenues ont par la suite conduit au développement de l' hypothèse d'adhésion différentielle par Malcolm Steinberg . Avec l'avènement du domaine de la biologie des cellules souches , le potentiel des cellules souches à former des organes in vitro a été réalisé très tôt avec l'observation que lorsque les cellules souches forment des tératomes ou des corps embryoïdes , les cellules différenciées peuvent s'organiser en différentes structures ressemblant à celles trouvées dans plusieurs types de tissus . L'avènement du domaine des organoïdes a commencé par un passage de la culture et de la différenciation des cellules souches dans des milieux 2D à des milieux 3D pour permettre le développement des structures tridimensionnelles complexes des organes. Depuis 1987, les chercheurs ont mis au point différentes méthodes de culture en 3D et ont pu utiliser différents types de cellules souches pour générer des organoïdes ressemblant à une multitude d'organes. En 2006, Yaakov Nahmias et David Odde ont montré l'auto-assemblage d' organoïdes vasculaires hépatiques maintenus pendant plus de 50 jours in vitro . En 2008, Yoshiki Sasai et son équipe de l' institut RIKEN ont démontré que les cellules souches peuvent être transformées en boules de cellules neurales qui s'auto-organisent en couches distinctes. En 2009, le laboratoire de Hans Clevers à l' Institut Hubrecht et au Centre médical universitaire d'Utrecht , aux Pays-Bas, a montré que des cellules souches intestinales exprimant LGR5 s'auto-organisent en structures crypt-villos in vitro sans nécessité d'une niche mésenchymateuse . En 2010, Mathieu Unbekandt & Jamie A. Davies ont démontré la production d'organoïdes rénaux à partir de cellules souches rénogéniques dérivées de fœtus murins. Des rapports ultérieurs ont montré une fonction physiologique significative de ces organoïdes in vitro et in vivo .

En 2013, Madeline Lancaster de l' Institut de biotechnologie moléculaire de l' Académie autrichienne des sciences a établi un protocole de culture d'organoïdes cérébraux dérivés de cellules souches qui imitent l'organisation cellulaire du cerveau humain en développement. En 2014, Artem Shkumatov et al. à l'Université de l'Illinois à Urbana-Champaign a démontré que les organoïdes cardiovasculaires peuvent être formés à partir de cellules ES par modulation de la rigidité du substrat auquel ils adhèrent. La rigidité physiologique a favorisé la tridimensionnalité des EB et la différenciation cardiomyogénique.

Takebe et al. démontrer une méthode généralisée pour la formation de bourgeons d'organes à partir de divers tissus en combinant des progéniteurs spécifiques de tissus dérivés de cellules souches pluripotentes ou des échantillons de tissus pertinents avec des cellules endothéliales et des cellules souches mésenchymateuses. Ils ont suggéré que les tissus moins matures, ou bourgeons d'organes, générés par le principe de condensation auto-organisée pourraient être l'approche la plus efficace pour la reconstitution des fonctions des organes matures après la transplantation, plutôt que les condensats générés à partir de cellules à un stade plus avancé.

Propriétés

Lancaster et Knoblich définissent un organoïde comme un ensemble de types de cellules spécifiques à un organe qui se développe à partir de cellules souches ou de progéniteurs d'organes, s'auto-organise par tri cellulaire et engagement de lignée spatialement restreint d'une manière similaire à in vivo , et présente les propriétés suivantes :

• il a plusieurs types de cellules spécifiques d'organes;
• il est capable de récapituler une fonction spécifique de l'organe (par exemple contraction , activité neurale , sécrétion endocrinienne , filtration, excrétion );
• ses cellules sont regroupées et organisées spatialement, à la manière d'un organe.

Traiter

La formation d'organoïdes nécessite généralement la culture des cellules souches ou des cellules progénitrices dans un milieu 3D. Le milieu 3D peut être fabriqué à l'aide d'un hydrogel à matrice extracellulaire tel que Matrigel ou Cultrex BME, qui est une matrice extracellulaire riche en laminine qui est sécrétée par la lignée tumorale Engelbreth-Holm-Swarm. Des corps organoïdes peuvent ensuite être fabriqués en incorporant des cellules souches dans le milieu 3D. Lorsque des cellules souches pluripotentes sont utilisées pour la création de l'organoïde, les cellules sont généralement, mais pas toujours, autorisées à former des corps embryoïdes . Ces corps embryoïdes sont ensuite traités pharmacologiquement avec des facteurs de structuration pour conduire à la formation de l'identité organoïde souhaitée. Des organoïdes ont également été créés à partir de cellules souches adultes extraites de l'organe cible et cultivées dans des milieux 3D.

Les types

Une multitude de structures d'organes ont été récapitulées à l'aide d'organoïdes. Cette section vise à décrire l'état du domaine à ce jour en fournissant une liste abrégée des organoïdes qui ont été créés avec succès, ainsi qu'un bref aperçu basé sur la littérature la plus récente pour chaque organoïde, et des exemples de la façon dont il a été utilisé dans la recherche.

Organoïde cérébral

Un organoïde cérébral décrit des organes miniatures cultivés artificiellement, in vitro , ressemblant au cerveau . Les organoïdes cérébraux sont créés en cultivant des cellules souches pluripotentes humaines dans une structure tridimensionnelle à l'aide d'un bioréacteur rotatif et se développent sur plusieurs mois. La procédure a des applications potentielles dans l'étude du développement, de la physiologie et de la fonction du cerveau. Les organoïdes cérébraux peuvent ressentir des « sensations simples » en réponse à une stimulation externe et les neuroscientifiques Andrea Lavazza , Elan Ohayon et Hideya Sakaguchi font partie de ceux qui craignent que de tels organes ne développent une sensibilité . Ils proposent que la poursuite de l'évolution de la technique soit soumise à une procédure de contrôle rigoureuse.

Organoïde intestinal

Les organoïdes intestinaux font référence aux organoïdes qui récapitulent les structures du tractus gastro-intestinal. Le tractus gastro-intestinal naît de l' endoderme , qui au cours du développement forme un tube qui peut être divisé en trois régions distinctes, qui donnent naissance, avec d'autres organes, aux sections suivantes du tractus gastro-intestinal :

1. L'intestin antérieur donne naissance à la cavité buccale et à l'estomac
2. L'intestin moyen donne naissance à l'intestin grêle et au côlon ascendant
3. L'intestin postérieur donne naissance au rectum et au reste du côlon

Les organoïdes ont été créés pour les structures suivantes du tractus gastro-intestinal :

Organoïde intestinal

Les organoïdes intestinaux ont jusqu'à présent été parmi les organoïdes intestinaux à générer directement à partir de cellules souches pluripotentes. Une façon dont les cellules souches pluripotentes humaines peuvent être amenées à former des organoïdes intestinaux consiste d'abord à appliquer de l' activine A pour conduire les cellules à une identité mésoendodermique, suivie de la régulation à la hausse pharmacologique des voies de signalisation Wnt3a et Fgf4 , car il a été démontré qu'elles favorisent l'intestin postérieur. sort. Des organoïdes intestinaux ont également été générés à partir de cellules souches intestinales, extraites de tissus adultes et cultivées dans des milieux 3D. Ces organoïdes dérivés de cellules souches adultes sont souvent appelés entéroïdes ou colonoïdes, selon leur segment d'origine, et ont été établis à partir de l'intestin humain et murin. Les organoïdes intestinaux sont constitués d'une seule couche de cellules épithéliales intestinales polarisées entourant une lumière centrale. En tant que tel, récapitulez la structure crypte-villosités de l'intestin, en récapitulant sa fonction, sa physiologie et son organisation, et en maintenant tous les types cellulaires trouvés normalement dans la structure, y compris les cellules souches intestinales. Ainsi, les organoïdes intestinaux sont un modèle précieux pour étudier le transport intestinal des nutriments, l'absorption de médicaments, la sécrétion d'hormones incrétines et l'infection par divers entéropathogènes. Les organoïdes intestinaux récapitulent la structure crypte-villos avec un degré élevé de fidélité qu'ils ont été transplantés avec succès dans des intestins de souris, et sont donc hautement considérés comme un modèle précieux pour la recherche. L'un des domaines de recherche utilisé par les organoïdes intestinaux est celui de la niche des cellules souches. Les organoïdes intestinaux ont été utilisés pour étudier la nature de la niche des cellules souches intestinales , et les recherches effectuées avec eux ont démontré le rôle positif de l' IL-22 dans le maintien dans les cellules souches intestinales, ainsi que le rôle d'autres types de cellules comme les neurones et les fibroblastes dans le maintien. de cellules souches intestinales. Dans le domaine de la biologie des infections, différents systèmes modèles à base d'organoïdes intestinaux ont été explorés. D'une part, les organoïdes peuvent être infectés en masse en les mélangeant simplement avec l' entéropathogène d'intérêt. Cependant, pour modéliser l'infection par une voie plus naturelle à partir de la lumière intestinale, une micro-injection de l' agent pathogène est nécessaire. De plus, la polarité des organoïdes intestinaux peut être inversée, et ils peuvent même être dissociés en cellules individuelles et cultivés en monocouches 2D afin de rendre plus facilement accessibles les faces apicale et basolatérale de l'épithélium. Les organoïdes intestinaux ont également démontré un potentiel thérapeutique.

Afin de récapituler plus précisément l'intestin in vivo , des co-cultures d'organoïdes intestinaux et de cellules immunitaires ont été développées. De plus, les modèles d'organes sur puce combinent des organoïdes intestinaux avec d'autres types de cellules telles que les cellules endothéliales ou immunitaires ainsi que le flux péristaltique .

Estomac ou organoïde gastrique

Les organoïdes gastriques récapitulent au moins en partie la physiologie de l' estomac . Les organoïdes gastriques ont été générés directement à partir de cellules souches pluripotentes grâce à la manipulation temporelle des voies de signalisation FGF , WNT , BMP , acide rétinoïque et EGF dans des conditions de culture tridimensionnelles. Des organoïdes gastriques ont également été générés à l'aide de cellules souches adultes de l' estomac exprimant LGR5 . Les organoïdes gastriques ont été utilisés comme modèle pour l'étude du cancer ainsi que de la maladie et du développement humains. Par exemple, une étude a examiné les altérations génétiques sous-jacentes à la population tumorale métastatique d' un patient et a identifié que contrairement à la tumeur primaire du patient, la métastase avait les deux allèles du gène TGFBR2 muté. Pour évaluer davantage le rôle de TGFBR2 dans la métastase, les chercheurs ont créé des organoïdes où l'expression de TGFBR2 est renversée, grâce auxquels ils ont pu démontrer que l'activité réduite de TGFBR2 conduit à l'invasion et à la métastase de tumeurs cancéreuses à la fois in vitro et in vivo .

Organoïde lingual

Les organoïdes linguaux sont des organoïdes qui récapitulent, au moins en partie, des aspects de la physiologie de la langue. Des organoïdes épithéliaux linguaux ont été générés en utilisant BMI1 exprimant des cellules souches épithéliales dans des conditions de culture tridimensionnelles grâce à la manipulation d' EGF , de WNT et de TGF-β . Cette culture organoïde, cependant, manque de récepteurs du goût , car ces cellules ne proviennent pas de cellules souches épithéliales exprimant Bmi1. Cependant, les organoïdes des papilles gustatives linguales contenant des cellules gustatives ont été créés à l'aide des cellules souches/progénitrices LGR5 + ou CD44 + du tissu papillaire circumvallate (CV). Ces organoïdes des papilles gustatives ont été créés avec succès à la fois directement à partir de cellules souches/progénitrices du goût exprimant Lgr5 ou LGR6 . et indirectement, par l'isolement, la digestion et la culture ultérieure de tissu CV contenant des cellules souches/progénitrices Lgr5+ ou CD44+.

Autres types d'organoïdes

• Organoïde thyroïdien
• Organoïde thymique

Les organoïdes thymiques récapitulent au moins en partie l'architecture et la fonctionnalité de niche des cellules souches du thymus , qui est un organe lymphoïde où les cellules T mûrissent. Les organoïdes thymiques ont été générés par l'ensemencement de cellules stromales thymiques en culture tridimensionnelle. Organites thymiques semblent récapituler avec succès la fonction du thymus, en tant que co-culture de l' homme les cellules souches hématopoïétiques ou de moelle osseuse avec des organites de souris thymiques a abouti à la production de lymphocytes T .

• Organoïde testiculaire
• Organoïde de la prostate
• Organoïde hépatique
• Organoïde pancréatique

Les progrès récents dans les plaques de microtitrage répulsifs cellulaires ont permis un criblage rapide et rentable de grandes bibliothèques de médicaments à petites molécules contre des modèles 3D de cancer du pancréas. Ces modèles sont cohérents dans les profils de phénotype et d'expression avec ceux trouvés dans le laboratoire du Dr David Tuveson .

• Organoïde épithélial
• Organoïde pulmonaire
• Organoïde du rein
• Gastruloïde (organoïde embryonnaire) - Génère tous les axes embryonnaires et implémente pleinement les modèles d'expression colinéaire du gène Hox le long de l'axe antéropostérieur.
• Blastoïde (organoïde de type blastocyste)
• Organoïde cardiaque - En 2018, les organoïdes cardiaques creux ont été conçus pour battre et pour répondre aux stimuli pour battre plus vite ou plus lentement.
• Organoïde rétinien
• Glioblastome organoïde

Des modèles organoïdes 3D de cancer du cerveau dérivés d'explants dérivés de patients (PDX) ou directement de tissus cancéreux sont désormais facilement réalisables et permettent un dépistage à haut débit de ces tumeurs par rapport au panel actuel de médicaments approuvés dans le monde.

Recherche basique

Les organoïdes permettent d'étudier comment les cellules interagissent entre elles dans un organe, leur interaction avec leur environnement, comment les maladies les affectent et l'effet des médicaments. La culture in vitro rend ce système facile à manipuler et facilite leur suivi. Alors que les organes sont difficiles à cultiver car leur taille limite la pénétration des nutriments, la petite taille des organoïdes limite ce problème. En revanche, ils ne présentent pas toutes les caractéristiques des organes et les interactions avec d'autres organes ne sont pas récapitulées in vitro . Alors que la recherche sur les cellules souches et la régulation de la souche était le premier domaine d'application des organoïdes intestinaux, ils sont maintenant également utilisés pour étudier, par exemple, l'absorption de nutriments, le transport de médicaments et la sécrétion d' hormones incrétines . Ceci est d'une grande importance dans le contexte des maladies de malabsorption ainsi que des maladies métaboliques telles que l' obésité , la résistance à l'insuline et le diabète .

Modèles de maladie

Les organoïdes offrent la possibilité de créer des modèles cellulaires de maladies humaines, qui peuvent être étudiés en laboratoire pour mieux comprendre les causes des maladies et identifier les traitements possibles. Dans un exemple, le système d'édition du génome appelé CRISPR a été appliqué à des cellules souches pluripotentes humaines pour introduire des mutations ciblées dans des gènes pertinents pour deux maladies rénales différentes, la maladie polykystique des reins et la glomérulosclérose segmentaire focale . Ces cellules souches pluripotentes modifiées par CRISPR ont ensuite été cultivées en organoïdes rénaux humains, qui présentaient des phénotypes spécifiques à la maladie. Les organoïdes rénaux des cellules souches avec des mutations de la maladie polykystique des reins ont formé de grandes structures de kystes translucides à partir des tubules rénaux. Cultivés en l'absence d'indices adhérents (en suspension), ces kystes ont atteint des tailles de 1 cm de diamètre sur plusieurs mois. Les organoïdes rénaux avec des mutations dans un gène lié à la glomérulosclérose segmentaire focale ont développé des défauts de jonction entre les podocytes, les cellules filtrantes affectées dans cette maladie. Il est important de noter que ces phénotypes de la maladie étaient absents chez les organoïdes témoins de fond génétique identique, mais dépourvus des mutations CRISPR. La comparaison de ces phénotypes organoïdes avec des tissus malades de souris et d'humains a suggéré des similitudes avec les défauts du développement précoce.

Comme développé pour la première fois par Takahashi et Yamanaka en 2007, les cellules souches pluripotentes induites (iPSC) peuvent également être reprogrammées à partir de fibroblastes cutanés de patients. Ces cellules souches portent le bagage génétique exact du patient, y compris toutes les mutations génétiques qui pourraient contribuer au développement d'une maladie humaine. La différenciation de ces cellules en organoïdes rénaux a été réalisée chez des patients atteints du syndrome de Lowe en raison de mutations ORCL1 . Ce rapport a comparé les organoïdes rénaux différenciés de l'iPSC du patient à l'iPSC témoin non apparenté et a démontré une incapacité des cellules rénales du patient à mobiliser le facteur de transcription SIX2 du complexe de Golgi . Étant donné que SIX2 est un marqueur bien caractérisé des cellules progénitrices du néphron dans le mésenchyme de la coiffe , les auteurs ont conclu que l'insuffisance rénale fréquemment observée dans le syndrome de Lowe (insuffisance globale de la réabsorption des tubules proximaux ou syndrome de Fanconi rénal ) pourrait être liée à une altération de la structuration du néphron résultant du néphron. cellules progénitrices dépourvues de cette expression importante du gène SIX2 .

D'autres études ont utilisé l'édition de gènes CRISPR pour corriger la mutation du patient dans les cellules iPSC du patient afin de créer un contrôle isogénique , qui peut être effectué simultanément avec la reprogrammation iPSC. La comparaison d'un organoïde dérivé d'iPSC d'un patient par rapport à un contrôle isogénique est l'étalon-or actuel dans le domaine car elle permet l'isolement de la mutation d'intérêt comme la seule variable dans le modèle expérimental. Dans l'un de ces rapports, des organoïdes rénaux dérivés de l'iPSC d'un patient atteint du syndrome de Mainzer-Saldino en raison de mutations hétérozygotes composites dans IFT140 ont été comparés à un organoïde de contrôle isogénique dans lequel un variant IFT140 donnant lieu à un transcrit d'ARNm non viable a été corrigé par CRISPR . Les organoïdes de rein de patients ont présenté une morphologie ciliaire anormale cohérente avec les modèles animaux existants qui ont été récupérés à la morphologie de type sauvage dans les organoïdes à gène corrigé. Le profilage transcriptionnel comparatif des cellules épithéliales purifiées à partir d'organoïdes de patient et de contrôle a mis en évidence des voies impliquées dans la polarité cellulaire , les jonctions cellule-cellule et l' assemblage moteur de la dynéine , dont certaines avaient été impliquées pour d'autres génotypes au sein de la famille phénotypique des ciliopathies rénales. Un autre rapport utilisant un contrôle isogénique a démontré une localisation anormale de la néphrine dans les glomérules des organoïdes rénaux générés par un patient atteint d'un syndrome néphrotique congénital .

Médecine personnalisée

Des organoïdes intestinaux issus de biopsies rectales utilisant des protocoles de culture établis par le groupe Clevers ont été utilisés pour modéliser la mucoviscidose et ont conduit à la première application d'organoïdes pour un traitement personnalisé. La mucoviscidose est une maladie héréditaire causée par des mutations géniques du gène régulateur de la conductance transmembranaire de la mucoviscidose qui code pour un canal ionique épithélial nécessaire à la santé des fluides épithéliaux de surface. Des études menées par le laboratoire de Jeffrey Beekman (Wilhelmina Children's Hospital, University Medical Center Utrecht, Pays-Bas) ont décrit en 2013 que la stimulation des organoïdes colorectaux avec des agonistes augmentant l'AMPc tels que la forskoline ou la toxine cholérique induisait un gonflement rapide des organoïdes d'une manière entièrement dépendante du CFTR . Alors que les organoïdes provenant de sujets non atteints de mucoviscidose gonflent en réponse à la forskoline en raison du transport de fluide dans les lumières des organoïdes, celui-ci est sévèrement réduit ou absent chez les organoïdes dérivés de personnes atteintes de mucoviscidose. Le gonflement pourrait être restauré par des thérapies qui réparent la protéine CFTR (modulateurs CFTR), indiquant que les réponses individuelles à la thérapie modulante CFTR pourraient être quantifiées dans un environnement de laboratoire préclinique. Schwank et al. a également démontré que le phénotype organoïde de la mucoviscidose intestinale pouvait être réparé par édition du gène CRISPR-Cas9 en 2013.

Des études de suivi par Dekkers et al. en 2016 a révélé que des différences quantitatives dans le gonflement induit par la forskoline entre les organoïdes intestinaux dérivés de personnes atteintes de mucoviscidose s'associent à des marqueurs diagnostiques et pronostiques connus tels que des mutations du gène CFTR ou des biomarqueurs in vivo de la fonction CFTR. En outre, les auteurs ont démontré que les réponses du modulateur CFTR dans les organoïdes intestinaux présentant des mutations spécifiques de CFTR étaient en corrélation avec les données d'essais cliniques publiées sur ces traitements. Cela a conduit à des études précliniques où les organoïdes provenant de patients présentant des mutations CFTR extrêmement rares pour lesquels aucun traitement n'a été enregistré se sont avérés répondre fortement à un modulateur CFTR disponible en clinique. Le bénéfice clinique suggéré du traitement pour ces sujets sur la base du test organoïde préclinique a ensuite été confirmé lors de l'introduction clinique du traitement par des membres du centre clinique de mucoviscidose sous la supervision de Kors van der Ent (Département de pneumologie pédiatrique, Hôpital pour enfants Wilhelmina, Centre médical universitaire Utrecht, Pays-Bas). Ces études montrent pour la première fois que les organoïdes peuvent être utilisés pour l'adaptation individuelle d'une thérapie ou d' une médecine personnalisée .

Un modèle pour la biologie du développement

Les organoïdes offrent aux chercheurs un modèle exceptionnel pour étudier la biologie du développement . Depuis l'identification des cellules souches pluripotentes , il y a eu de grands progrès dans la direction du destin des cellules souches pluripotentes in vitro à l' aide de cultures 2D. Ces progrès dans la direction du destin de la PSC, associés aux progrès des techniques de culture 3D, ont permis la création d'organoïdes qui récapitulent les propriétés de diverses sous-régions spécifiques d'une multitude d'organes. L'utilisation de ces organoïdes a ainsi grandement contribué à élargir notre compréhension des processus de l' organogenèse et du domaine de la biologie du développement. Dans le développement du système nerveux central , par exemple, les organoïdes ont contribué à notre compréhension des forces physiques qui sous-tendent la formation de la cupule rétinienne. Des travaux plus récents ont considérablement prolongé les périodes de croissance des organoïdes corticaux et à près d'un an dans des conditions de différenciation spécifiques, les organoïdes persistent et présentent certaines caractéristiques des stades de développement fœtal humain.

Les références

Lectures complémentaires