Complexe de silençage induit par l'ARN - RNA-induced silencing complex

Le complexe de silençage induit par l'ARN , ou RISC , est un complexe multiprotéique , en particulier une ribonucléoprotéine , qui fonctionne dans le silençage génique via une variété de voies aux niveaux transcriptionnel et traductionnel. En utilisant des fragments d' ARN simple brin (ARNss), tels que des microARN (miARN) ou des petits ARN interférents double brin (siARN), le complexe fonctionne comme un outil clé dans la régulation des gènes. Le simple brin d'ARN agit comme une matrice pour que RISC reconnaisse le transcrit de l'ARN messager complémentaire (ARNm) . Une fois trouvée, l'une des protéines de RISC, Argonaute , active et clive l'ARNm. Ce processus est appelé ARN interférence (ARNi) et on le retrouve chez de nombreux eucaryotes ; c'est un processus clé dans la défense contre les infections virales , car il est déclenché par la présence d'ARN double brin (dsRNA).

Découverte

L' identification biochimique du RISC a été menée par Gregory Hannon et ses collègues du Cold Spring Harbor Laboratory . Ce n'était que quelques années après la découverte de l'interférence ARN en 1998 par Andrew Fire et Craig Mello , qui partageaient le prix Nobel 2006 de physiologie ou médecine .

Drosophila melanogaster

Hannon et ses collègues ont tenté d'identifier les mécanismes d'ARNi impliqués dans le silençage génique , par les ARNdb, dans les cellules de drosophile . Des cellules de drosophile S2 ont été transfectées avec un vecteur d'expression lacZ pour quantifier l'expression génique avec une activité β-galactosidase . Leurs résultats ont montré que la co-transfection avec l' ARNdb lacZ réduisait significativement l'activité de la β-galactosidase par rapport à l'ARNdb témoin. Par conséquent, les ARNdb contrôlent l'expression des gènes via la complémentarité des séquences .

Les cellules S2 ont ensuite été transfectées avec l' ARNdb de Drosophila cycline E. Cycline E est un gène essentiel pour le cycle cellulaire progression dans la phase S . L'ARNdb de la cycline E a arrêté le cycle cellulaire à la phase G ₁ (avant la phase S). Par conséquent, l'ARNi peut cibler des gènes endogènes .

De plus, l'ARNdb de la cycline E ne diminuait que l'ARNdb de la cycline E - un résultat similaire a également été montré en utilisant l'ARNdb correspondant à la cycline A qui agit dans les phases S, G ₂ et M du cycle cellulaire. Ceci montre la marque caractéristique de l'ARNi : les niveaux réduits d'ARNm correspondent aux niveaux d'ARNdb ajoutés.

Pour tester si leur observation d'une diminution des niveaux d'ARNm était le résultat d'un ciblage direct de l'ARNm (comme le suggèrent les données d'autres systèmes), les cellules de Drosophila S2 ont été transfectées avec des ARNdb de cycline E de Drosophila ou des ARNdb de lacZ , puis incubées avec des ARNm synthétiques pour la cycline E ou lacZ .

Les cellules transfectées avec les ARNdb de la cycline E n'ont montré de dégradation que dans les transcrits de la cycline E - les transcrits lacZ étaient stables. A l'inverse, les cellules transfectées avec des ARNdb lacZ n'ont montré de dégradation que dans les transcrits lacZ et non dans les transcrits de cycline E. Leurs résultats ont conduit Hannon et ses collègues à suggérer que l'ARNi dégrade l'ARNm cible par le biais d'une « activité nucléase spécifique à la séquence ». Ils ont appelé l' enzyme nucléase RISC.

Fonction dans l'interférence ARN

Le domaine PIWI d'une protéine Argonaute en complexe avec de l'ARN double brin.

Incorporation de siRNA/miRNA

Le RNase III Dicer est un membre essentiel de RISC qui initie le processus d'interférence ARN en produisant des siARN double brin ou des miARN simple brin. Le clivage enzymatique de l'ARNdb dans la cellule produit les courts fragments d'ARNsi de 21 à 23 nucléotides de long avec un surplomb 3' de deux nucléotides . Dicer traite également le pré-miARN, qui forme une structure en boucle en épingle à cheveux pour imiter l'ARNdb, de la même manière. Des fragments d'ARNdb sont chargés dans RISC, chaque brin ayant un destin différent basé sur le phénomène de règle d'asymétrie, la sélection d'un brin comme brin guide par rapport à l'autre basée sur la stabilité thermodynamique. Les miARN ou siARN nouvellement générés agissent comme des séquences de guidage simple brin pour que RISC cible l'ARNm pour la dégradation.

• Le brin avec l' extrémité 5' la moins stable thermodynamiquement est sélectionné par la protéine Argonaute et intégré dans RISC. Ce brin est connu sous le nom de brin guide et cible l'ARNm pour la dégradation.
• L'autre brin, dit brin passager, est dégradé par RISC.

Une partie de la voie d'interférence ARN avec les différentes façons dont RISC peut faire taire les gènes via leur ARN messager.

Régulation des gènes

Les principales protéines de RISC, Ago2, SND1 et AEG-1 jouent un rôle crucial dans la fonction de silençage génique du complexe.

RISC utilise le brin guide de miARN ou siARN pour cibler les régions 3' non traduites complémentaires (3'UTR) des transcrits d'ARNm via l' appariement de bases Watson-Crick , ce qui lui permet de réguler l'expression génique du transcrit d'ARNm de plusieurs manières.

dégradation de l'ARNm

La fonction la plus comprise de RISC est la dégradation de l'ARNm cible qui réduit les niveaux de transcrit disponibles pour être traduits par les ribosomes . Le clivage endonucléolytique de l'ARNm complémentaire du brin guide du RISC par la protéine Argonaute est la clé de l'initiation de l'ARNi. Il y a deux conditions principales pour que la dégradation de l'ARNm ait lieu :

• une correspondance complémentaire presque parfaite entre le brin guide et la séquence d'ARNm cible, et,
• une protéine Argonaute catalytiquement active, appelée « trancheur », pour cliver l'ARNm cible.

Il existe deux voies principales de dégradation de l'ARNm une fois que le clivage s'est produit. Les deux sont initiés par la dégradation de la queue poly(A) de l'ARNm, entraînant l'élimination de la coiffe 5' de l'ARNm.

• Dégradation 5'-à-3' de la transcription se produit par XRN1 exonucléase dans cytoplasmiques corps appelés corps P .
• La dégradation 3'-à-5' du transcrit est réalisée par l' exosome et le complexe Ski .

La répression translationnelle

RISC peut moduler le chargement du ribosome et des facteurs accessoires dans la traduction pour réprimer l' expression du transcrit d'ARNm lié. La répression traductionnelle ne nécessite qu'une correspondance de séquence partielle entre le brin guide et l'ARNm cible.

La traduction peut être réglée à l'étape d'initiation par :

• empêchant la liaison du facteur d'initiation de la traduction eucaryote (eIF) à la coiffe 5' . Il a été noté que RISC peut déadényler la queue poly(A) 3', ce qui pourrait contribuer à la répression via la coiffe 5'.
• empêcher la liaison de la sous-unité ribosomique 60S à l'ARNm peut réprimer la traduction.

La traduction peut être régulée aux étapes post-initiation par :

• dégradation des peptides,
• favorisant l'arrêt prématuré des ribosomes de traduction, ou,
• ralentissement de l'allongement.

Il y a encore des spéculations sur la question de savoir si la répression traductionnelle via l'initiation et la post-initiation est mutuellement exclusive.

Formation d'hétérochromatine

Certains RISC sont capables de cibler directement le génome en recrutant des histones méthyltransférases pour former de l' hétérochromatine au locus du gène , faisant taire le gène. Ces RISC prennent la forme d'un complexe de silençage transcriptionnel induit par l'ARN (RITS). L'exemple le mieux étudié est celui de la levure RITS.

Il a été démontré que RITS dirige la formation d'hétérochromatine au niveau des centromères grâce à la reconnaissance des répétitions centromériques. Grâce à l'appariement de bases d'ARNsi (brin guide) pour cibler les séquences de chromatine, des enzymes modifiant les histones peuvent être recrutées.

Le mécanisme n'est pas bien compris ; cependant, les RITS dégradent les transcrits d'ARNm naissants. Il a été suggéré que ce mécanisme agit comme une « boucle de rétroaction auto-renforçante » car les transcrits naissants dégradés sont utilisés par l'ARN polymérase dépendante de l'ARN (RdRp) pour générer plus d'ARNsi.

Chez Schizosaccharomyces pombe et Arabidopsis , le traitement des cibles d'ARNdb en ARNsi par Dicer RNases peut initier une voie de silençage génique par formation d'hétérochromatine. Une protéine Argonaute connue sous le nom d' AGO4 interagit avec les petits ARN qui définissent les séquences hétérochromatiques. Une histone méthyl transférase (HMT), H3K9 , méthyle l'histone H3 et recrute des protéines de chromodomaine sur les sites de méthylation. La méthylation de l'ADN maintient le silence des gènes car les séquences d'hétérochromatine peuvent être établies ou propagées.

élimination de l'ADN

Les siRNA générés par les RISC semblent avoir un rôle dans la dégradation de l'ADN au cours du développement du macronoyau somatique chez les protozoaires Tetrahymena . Il est similaire au contrôle épigénétique de la formation d'hétérochromatine et est impliqué comme une défense contre les éléments génétiques envahissants.

Semblable à la formation d'hétérochromatine chez S. pombe et Arabidopsis , une  protéine Tetrahymena apparentée à la famille Argonaute, Twi1p, catalyse l'élimination de l'ADN de séquences cibles connues sous le nom de séquences d'élimination interne (IES). À l'aide de méthyltransférases et de protéines chromodomaines, les IES sont hétérochromatisées et éliminées de l'ADN.

Protéines associées à RISC

La structure complète de RISC n'est toujours pas résolue. De nombreuses études ont signalé une gamme de tailles et de composants pour RISC, mais il n'est pas tout à fait sûr que cela soit dû à un certain nombre de complexes RISC ou aux différentes sources utilisées par différentes études.

Il y a, Argonaute ; Dcr, Dicer ; Dmp68, D. melanogaster orthologue de l'ARN unwindase p68 de mammifère; eIF2C1, facteur d'initiation de la traduction eucaryote 2C1 ; eIF2C2, facteur d'initiation de la traduction eucaryote 2C2 ; Fmr1/Fxr, D. melanogaster orthologue de la protéine de retard mental fragile-X; miRNP, complexe miARN-protéine; NR, non rapporté ; Tsn, nucléase Tudor-staphylococcique; Vig, gène intronique vasa.

Protéine d'argonaute pleine longueur de l'espèce d'archaea Pyrococcus furiosus .

Quoi qu'il en soit, il est évident que les protéines Argonaute sont présentes et sont essentielles à la fonction. De plus, il existe des informations sur certaines des protéines clés (en plus de l'Argonaute) au sein du complexe, qui permettent à RISC de remplir sa fonction.

Protéines d'Argonaute

Les protéines argonautes sont une famille de protéines trouvées chez les procaryotes et les eucaryotes. Leur fonction chez les procaryotes est inconnue mais chez les eucaryotes, ils sont responsables de l'ARNi. Il y a huit membres de la famille chez les Argonautes humains dont seul Argonaute 2 est exclusivement impliqué dans le clivage ciblé de l'ARN dans RISC.

Le complexe de chargement RISC permet le chargement de fragments d'ARNdb (générés par Dicer) à charger sur Argonaute 2 (à l'aide de TRBP) dans le cadre de la voie d'interférence ARN.

Complexe de chargement RISC

Le complexe de chargement RISC (RLC) est la structure essentielle requise pour charger des fragments d'ARNdb dans RISC afin de cibler l'ARNm. Le RLC se compose de dicer, la protéine de liaison à l'ARN de la réponse transactivatrice ( TRBP ) et d'Argonaute 2.

• Dicer est une endonucléase RNase III qui génère les fragments d'ARNdb à charger qui dirigent l'ARNi.
• TRBP est une protéine avec trois domaines de liaison à l'ARN double brin .
• Argonaute 2 est une RNase et est le centre catalytique de RISC.

Dicer s'associe à TRBP et Argonaute 2 pour faciliter le transfert des fragments d'ARNdb générés par Dicer vers Argonaute 2.

Des recherches plus récentes ont montré que l' ARN hélicase A humaine pourrait aider à faciliter le RLC.

Autres protéines

Les membres récemment identifiés du RISC sont SND1 et MTDH . SND1 et MTDH sont des oncogènes et régulent l'expression de divers gènes.

Il y a, Argonaute ; Dcr, Dicer ; Dmp68, D. melanogaster orthologue de l'ARN unwindase p68 de mammifère; eIF2C1, facteur d'initiation de la traduction eucaryote 2C1 ; eIF2C2, facteur d'initiation de la traduction eucaryote 2C2 ; Fmr1/Fxr, D. melanogaster orthologue de la protéine de retard mental fragile-X; Tsn, nucléase Tudor-staphylococcique; Vig, gène intronique vasa.

Liaison de l'ARNm

Diagramme de l'activité RISC avec les miARN

On ne sait pas encore comment le complexe RISC activé localise les cibles d'ARNm dans la cellule, bien qu'il ait été démontré que le processus peut se produire dans des situations en dehors de la traduction en cours des protéines à partir de l'ARNm.

Les miARN exprimés de manière endogène chez les métazoaires ne sont généralement pas parfaitement complémentaires à un grand nombre de gènes et, par conséquent, ils modulent l'expression via la répression traductionnelle. Cependant, chez les plantes , le processus a une spécificité beaucoup plus grande pour cibler l'ARNm et généralement chaque miARN ne se lie qu'à un seul ARNm. Une plus grande spécificité signifie que la dégradation de l'ARNm est plus susceptible de se produire.

Voir également

• Silençage transcriptionnel induit par l'ARN (RITS)
• ARN interférence

Les références

Lectures complémentaires

Liens externes

• RNA-Induced+Silencing+Complex à la National Library of Medicine Medical Subject Headings (MeSH) des États-Unis