Cristallographie résolue en temps - Time resolved crystallography
La cristallographie résolue dans le temps utilise l' imagerie cristallographique aux rayons X pour visualiser les réactions en quatre dimensions (x, y, z et temps). Cela permet d'étudier les changements dynamiques qui se produisent par exemple dans les enzymes au cours de leur catalyse. La dimension temporelle est incorporée en déclenchant la réaction d'intérêt dans le cristal avant l' exposition aux rayons X , puis en collectant les diagrammes de diffraction à différents délais. Afin d'étudier ces propriétés dynamiques des macromolécules, trois critères doivent être remplis ;
- La macromolécule doit être biologiquement active à l'état cristallin
- Il doit être possible de déclencher la réaction dans le cristal
- L'intermédiaire d'intérêt doit être détectable, c'est-à-dire qu'il doit avoir une concentration raisonnable dans le cristal (de préférence supérieure à 25 %).
Cela a conduit au développement de plusieurs techniques qui peuvent être divisées en deux groupes, la méthode pompe-sonde et les méthodes de piégeage par diffusion.
Pompe-sonde
Dans la méthode pompe-sonde, la réaction est d'abord déclenchée (pompe) par photolyse (le plus souvent la lumière laser), puis un motif de diffraction est collecté par une impulsion de rayons X (sonde) à un délai spécifique. Ceci permet d'obtenir de nombreuses images à des délais différents après le déclenchement de la réaction, et ainsi de constituer une série chronologique d'images décrivant les événements au cours de la réaction. Pour obtenir un rapport signal sur bruit raisonnable, ce cycle pompe-sonde doit être effectué plusieurs fois pour chaque rotation spatiale du cristal, et plusieurs fois pour le même délai. Par conséquent, la réaction que l'on souhaite étudier avec la pompe-sonde doit pouvoir retrouver sa conformation d'origine après déclenchement, permettant de nombreuses mesures sur le même échantillon. La résolution temporelle des phénomènes observés est dictée par la largeur temporelle de l'impulsion de sondage ( pleine largeur à mi-hauteur ). Tous les processus qui se déroulent sur une échelle de temps plus rapide que cela vont être moyennés par la convolution de l'intensité de l'impulsion de la sonde dans le temps avec l'intensité de la réflectivité réelle des rayons X de l'échantillon.
Piège à diffusion
Les méthodes de piégeage par diffusion utilisent des techniques de diffusion pour faire pénétrer les substrats dans le cristal et ensuite différentes techniques de piégeage sont appliquées pour que l'intermédiaire d'intérêt s'accumule dans le cristal avant la collecte du motif de diffraction. Ces méthodes de piégeage pourraient impliquer des changements de pH , l'utilisation d'inhibiteurs ou l'abaissement de la température afin de ralentir le taux de renouvellement ou peut-être même d'arrêter complètement la réaction à une étape spécifique. Le simple fait de démarrer la réaction, puis de la congeler rapidement, l'éteignant ainsi à un pas de temps spécifique, est également une méthode possible. Un inconvénient des méthodes de piégeage par diffusion est qu'elles ne peuvent être utilisées que pour étudier les intermédiaires qui peuvent être piégés, limitant ainsi la résolution temporelle que l'on peut obtenir par les méthodes par rapport à la méthode pompe-sonde.